检索结果-南通市图书馆

作者：王依鹭中国医科大学

学位级别：硕士

前言近年来，化学腐蚀伤的发生率逐年增加。所有化学性眼灼伤中以碱烧伤的损害最为严重。大量研究发现，基质金属蛋白酶(MMP)在碱烧伤后角膜溃疡的发生发展过程中可能具有重要作用。一直以来，人们都在试图寻找理想的内部和外部基质金... 详细信息

前言近年来，化学腐蚀伤的发生率逐年增加。所有化学性眼灼伤中以碱烧伤的损害最为严重。大量研究发现，基质金属蛋白酶(MMP)在碱烧伤后角膜溃疡的发生发展过程中可能具有重要作用。一直以来，人们都在试图寻找理想的内部和外部基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)来预防碱烧伤后的不良后果，目前为止已经取得了较大的进展，但碱烧伤什么时期MMP的分泌达到最高峰，MMP的含量与角膜溶解是否同步发生及什么时期应用TIMP效果最佳尚无明确的定论。本实验通过建立大鼠角膜碱烧伤模型来观察碱烧伤后不同时间角膜内MMP-1及其抑制剂的表达，明确二者在碱烧伤后角膜溶解过程中的作用，以求为临床合理地应用TIMP来防治角膜溃疡提供必要的理论依据。实验材料实验动物选择健康SD大鼠35只。主要试剂与器材有兔抗大鼠MMP-1多克隆抗体、山羊抗大鼠TMMP-1多克隆抗体、过氧化物酶标羊抗兔IgG、兔抗羊IgG及SP试剂盒，免疫组化计算机图像分析系统等。实验方法实验组建立大鼠角膜碱烧伤模型。于碱烧伤后按实验分组处死大鼠，迅速取材后进行HE及免疫组化染色，检测MMP-1及TIMP-1在碱烧伤后不同时期角膜内的表达和变化。同期采用荧光素钠染色，于裂隙灯下观察角膜形态学的变化。结果正常大鼠角膜组织中无MMP4及其抑制剂的表达。实验鼠伤后第1天，角膜上皮缺失，基质纤维肿胀增粗，角膜缘出现炎细胞浸润;第4J天基质溃疡逐渐加深，大量炎细胞浸润，可出现基质层坏死、脱落;烧伤后第14天溃疡达高峰期，角膜溶解坏死加重，炎细胞浸润程度减轻;第ZI毛8天，溃疡逐步修复，可见基质纤维粘连。兔疫组化显示MMPl于伤后第1天开始升高，14天达到最高，此后呈现下降趋势，但仍高于正常对照。而TIMP＊早期有所表达，而后活性逐渐下降，伤后第14天降至最低水平，此后又再度上升，21天时达到最高。讨论碱烧伤后角膜溃疡的形成极大程度上是蛋白水解酶作用的结果。在诸多蛋白水解酶中，最主要的为基质金属蛋白酶，简称MMPS。MMPS是近年来发现的结构与功能相关的含锌肽链内切酶家族，根据其结构和作用底物的不同，MMPS可分为一种，其中MMP一在碱烧伤后角膜溃疡的形成发展中可能具有重要的作用。组织型基质金属蛋白酶抑制物（TIMPS）是近年来发现的一组多功能因子家族，目前已发现4个成员。其中TIMP＊为MMP一的内源性抑制物，可与活化的MMP1以1：l的比例结合，特异性地抑制其活性，对于维持细胞外基质oCM）的稳态具有重要的作用。检测碱烧伤后角膜组织中MMPI及其抑制剂的表达有助于深入研究角膜碱烧伤的机理。本实验通过免疫组化方法及病理图像分析系统对MMPl及TIMP上的有关研究表明，H者的表达在碱烧伤后不同时间内差异显著并与角膜溶解的临床病理过程具有同步性。通过对．2．TIMP1的研究可为尽早防治碱烧伤后角膜溃疡穿孔提供新的途径，在碱烧伤的治疗上具有潜在的价值。关于MMP＊与TIMP＊的激活和抑制的分子机制，以及为防治角膜溃疡穿孔如何合理地调节二者之间的平衡有待进一步研究。结论一、角膜溶解高峰期出现于碱烧伤后第14天。H、碱烧伤后第14天MMPl分泌达高峰，TIMP1分泌达最低点。三、角膜溶解的临床病理过程与MMPl及TIMPd分泌密切相关。

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韭菜籽中活性生物分子的分离纯化及活性表征

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作者：陈涛涛福州大学

学位级别：硕士

韭菜籽作为我国传统中药,具有重要的生理功能。本文以韭菜籽为研究对象,对其中的天然活性肽和蛋白质进行了分离纯化,并对其生物活性进行了深入的研究。论文主要包括以下主要内容：韭菜籽活性多肽的研究。采用酸法抽提,经凝胶过滤色谱和... 详细信息

韭菜籽作为我国传统中药,具有重要的生理功能。本文以韭菜籽为研究对象,对其中的天然活性肽和蛋白质进行了分离纯化,并对其生物活性进行了深入的研究。论文主要包括以下主要内容：韭菜籽活性多肽的研究。采用酸法抽提,经凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对活性多肽进行纯化。从韭菜籽中分离得到两个多肽,经液质联用仪鉴定为Gly-Ser-Gln (GSQ)和Ser-Asn-Ala (SNA)。 GSQ具有较强的抗氧化作用,不但能够有效地清除自由基,还能够保护L02细胞免受过氧化氢诱导引起的凋亡同时GSQ具有一定的抗菌活性;SNA为抗菌肽,能够有效地抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长。韭菜籽中凝集素蛋白的研究。采用磷酸盐缓冲液(pH 5.0)抽提活性蛋白,经离子交换色谱和凝胶过滤色谱分离纯化得到一个凝集素蛋白(Pro-1)。该蛋白为糖蛋白,糖含量为3.6±0.25%,由两个相同的亚基通过二硫键形成二聚体,分子量为23.6 kDa,其N末端前七个氨基酸残基为CVIAPVA。经圆二色谱测定,Pro-1蛋白的二级结构含量分别为：35.8% α-螺旋、8.6%β-折叠、18.3%转角和37.3%无规卷曲。Pro-1具有很好的热稳定性,在100℃处理1.0 h后凝集活性不受影响;但pH稳定性较差,在pH 2.0-6.0范围内,凝集活性基本不受影响;pH大于6以上时,凝集活性迅速降低,甚至完全丧失。Pro-1凝集活性在一定程度上能被果糖、甘露醇及山梨糖抑制,说明Pro-1为一种复杂型凝集素;Pro-1凝集活性可被10 mmol/L钡离子完全抑制,其他离子对其活性的影响较弱;Pro-1对细胞的抑制作用具有选择性,当Pro-1浓度为40μmol时,对肝癌细胞HepG2的增殖有明显的抑制作用,而对正常肝细胞L02和人直肠癌细胞Caco-2的生长抑制不明显。对钡离子抑制Pro-1活性的机理的探究。荧光色谱分析表明,钡离子通过静态和动态方式淬灭Pro-1内源性荧光。钡离子与Pro-1作用后,改变Pro-1空间构象,使酪氨酸残基附近结构区域疏水性的增加：圆二色谱分析发现,随着钡离子浓度的升高,Pro-1中二级结构单元α-螺旋和β-折叠结构的含量改变。故推测钡离子抑制Pro-1活性是通过改变Pro-1空间构象引起Pro-1糖结合区域结构改变或直接与Pro-1的糖结合区域结合,阻碍Pro-1的糖结合活性位点与细胞表面特异的糖侧链的结合实现的。

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基于生物技术的铁观音杀青物增香工艺研究

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作者：薛婉茹福州大学

学位级别：硕士

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维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

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作者：王朋中国医科大学

学位级别：硕士

目的增殖性玻璃体视网膜病变(简称PVR)是孔源性视网膜脱离(简称RRD)的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善，同时玻切手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素，因此，如何在PVR形成... 详细信息

目的增殖性玻璃体视网膜病变(简称PVR)是孔源性视网膜脱离(简称RRD)的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善，同时玻切手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素，因此，如何在PVR形成的早期就应用药物抑制其发生和发展是眼科医生急需解决的问题。视网膜色素上皮细胞(简称RPE)是PVR形成时最重要的细胞。抑制PVR的关键就是抑制RPE细胞的增殖。近期PVR研究的热点是借助凋亡途径控制细胞的增殖，主要是施加凋亡诱导剂，使迁移增殖的RPE细胞发生凋亡，从根本上阻止PVR膜的形成和进一步发展。现今用于诱导RPE细胞凋亡的药物主要是抗代谢药，这些药副作用大，患者不易接受。维拉帕米是一种可靠的钙通道阻滞剂，副作用小、方便、价廉、易于得到。研究证明，维拉帕米对其他组织细胞的凋亡具有双重调节作用，同时钙离子在凋亡中的作用也不十分清楚，且有关维拉帕米对RPE凋亡的诱导作用及机制国内外均未见报道。因此本实验进行了人视网膜色素上皮细胞原代和传代培养，施加维拉帕米诱导其凋亡，来确定诱导RPE凋亡的有效作用浓度和时间，从而为今后探讨维拉帕米在增殖性疾病中的临床应用奠定理论基础。方法一、组织来源及准备在无菌条件下，取我校一院眼科角膜移植后的供体眼球。二、人RPE细胞的培养无菌状态下，采用酶消化法，分离和种植人RPE细胞于24孔板内，待细胞融合后，胰酶传代。三机’I’f比色法测定药物对RPE增生的影响将第 3代 RPE细胞以 2 X 10’个／00gi的细胞密度接种于 96IL塑料培养板中，加人40m牙L，80m珍L，160m才L，320m牙L的维拉帕米，培养24小时后，应用M’I’f比色法，在全自动酶标仪上测其在490urn处的吸光值A。计算细胞增生抑制率，并对数据进行统计学分析。四、凋亡的检测将第3代的RPE细胞分三组进行凋亡检测。第一和第二组分别加人维拉帕米80mg／L和 160 mg／L，第三组作为对照组未加药。采用HE染色、AO荧光染色以及透射电镜进行观察。以80mg／L，160 mg／L浓度的维拉帕米，作用 12－72小日后，力人 PI染液后，经流式细胞仪检测。通过计算凋亡区（亚二倍体峰）细胞所占百分比得出凋亡率。结果在测定药物对RPE增生影响的实验中，细胞抑制率分别为13．55％、16．71％、42．34％和***％，随着浓度增大，细胞抑制率不断上升，结合方差分析和t检验证明维拉帕米对人RPE细胞增殖有明显的抑制作用，且呈明显的剂量依赖关系。结合光镜。电镜、荧光显微镜和流式细胞仪检测凋亡所得结果为80 mgll和160mg／l维拉帕米均可诱导RPE凋亡。在同一浓度时，随着时间延长，凋亡率不断增加，在同一时间内，药物浓度增加，凋亡率也不断增大，经统计学分析证明其差异具有显著性。结果显示 160mg／L维拉帕米作用 72小时，凋亡率可达 49．3％。结论 1．维拉帕米能有效抑制体外培养的人RPE细胞增生，且呈明 ·2·显的剂量依赖关系。 2．维拉帕米能够诱导体外培养的人RPE细胞凋亡，本实验条件下，160mg／L是诱导凋亡的最适浓度，72 ／J’时是凋亡的最佳作用时间。

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奇亚籽生物活性肽的分离纯化及其微胶囊产品开发

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作者：马倩福州大学

学位级别：硕士

奇亚籽作为一种新型食品原料,因其巨大的营养价值和治疗潜力而被誉为“超级食品”。为进一步拓宽奇亚籽的研究和应用,本文以脱脂奇亚籽为原料,采用碱提酸沉法提取粗蛋白并酶解制备活性多肽,系统地研究了其酶解工艺,酶解产物的分离纯化... 详细信息

奇亚籽作为一种新型食品原料,因其巨大的营养价值和治疗潜力而被誉为“超级食品”。为进一步拓宽奇亚籽的研究和应用,本文以脱脂奇亚籽为原料,采用碱提酸沉法提取粗蛋白并酶解制备活性多肽,系统地研究了其酶解工艺,酶解产物的分离纯化和结构鉴定,对其体外活性进行评价,同时对制得的活性多肽进行微胶囊化包埋,以改善其理化性质,为奇亚籽功能性产品的开发和进一步研究奠定了基础。论文主要内容如下:以奇亚籽脱脂粉为原料,在单因素的基础上,以DPPH自由基和羟基自由基清除率为指标,利用响应面法优化奇亚籽蛋白酶解工艺。最佳的酶解工艺为:以中性蛋白酶酶解,酶解温度50℃,加酶3170 U/g,p H 6.9,酶解4.9 h。此时,测得DPPH自由基和羟基自由基清除率分别为54.90%(0.5 mg/m L)、41.03%(1.0 mg/m L),与理论值均无显著差异。分别利用Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对酶解产物进行分离纯化,并通过超高效液相-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS/MS)鉴定多肽的氨基酸序列,得到三个抗氧化肽,其氨基酸序列和分子量分别为:His-Trp-Thr(HWT),442.19 Da;Ala-Phe(AF),236.11 Da;Phe-Tyr(FY),328.14 Da;一个ACE抑制肽为Thr-Trp(TW),305.13 Da。经氨基酸序列比对,发现HWT、TW为新肽序列,AF的序列有报道,但是抗氧化活性未有研究。以还原力和自由基清除能力为指标,同时构建HUVEC细胞的氧化损伤模型,进一步评价抗氧化肽的活性。结果表明,三肽HWT不但具有较强的还原力,并能有效清除ABTS自由基,其ORAC值高于谷胱甘肽。当浓度小于0.05 mg/m L时,三肽HWT对细胞无毒性,并对HO诱导的损伤细胞有明显的保护作用,且在0.05 mg/m L时达到最大。通过DCFH-DA荧光探针法进一步检测对细胞ROS水平的影响,发现HWT可降低损伤细胞内ROS水平,从而降低细胞氧化应激的损伤程度,表明HWT在细胞水平上表现出较好的抗氧化活性。此外,ACE抑制肽TW也表现出了较好的降压活性,IC值达到0.16 mg/m L。以包埋率、粒径等为评价指标,研究不同壁材组合和包埋方法对奇亚籽肽包埋的影响。结果表明明胶和阿拉伯胶复凝聚时包埋率高、粒径适中,分布系数较小,溶液体系较均一,较稳定。经过优化,得到奇亚籽多肽微胶囊的制备工艺为:以明胶和阿拉伯胶为壁材,壁材浓度2%,配比1:1,芯壁比1:2,以谷氨酰胺转氨酶为固化剂,固化剂用量0.25%(w/v),此时奇亚籽肽微胶囊包埋率约为82.5±0.3%。微胶囊粉末水分含量较原多肽有所降低,堆积密度提高,但流动性一般。制得的微胶囊颗粒结构相对完整,无裂缝及空洞,部分有粘连,大多成球形,总体包埋效果良好,在模拟胃肠液中具有一定缓释作用。

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人视网膜色素上皮细胞吞噬动力学及吞噬过程中cAMP浓度的变化

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作者：孙昱昭中国医科大学

学位级别：硕士

目的视网膜色素上皮细胞(RPE)的吞噬功能对维持正常视觉功能至关重要;该功能障碍时引起视细胞外节盘膜的堆积而导致严重的视网膜变性。目前对该细胞的吞噬机理至今尚未十分清楚，进一步探讨吞噬功能及其机制，将对这类疾病的预防... 详细信息

目的视网膜色素上皮细胞(RPE)的吞噬功能对维持正常视觉功能至关重要;该功能障碍时引起视细胞外节盘膜的堆积而导致严重的视网膜变性。目前对该细胞的吞噬机理至今尚未十分清楚，进一步探讨吞噬功能及其机制，将对这类疾病的预防和治疗带来希望。目前虽已知RPE细胞的特异性吞噬功能，涉及腺体-受体相互作用，启动跨膜信号传导系统，但是关于跨膜信号传导系统在RPE细胞特异性吞噬过程中所起的作用仍不十分清楚。为此我们选择信号传导通路中的一个第二信使分子cAMP作为研究对象，模拟在体条件下正常人RPE(HRPE)细胞的吞噬条件，在动态观察其特异性及非特异性吞噬的动力学特点的基础上，连续检测HRPE细胞不同吞噬阶段cAMP浓度的变化，探究HRPE细胞的吞噬功能与cAMP的关系。材料与方法 1．材料来源取自中国医科大学附属一院眼科角膜移植术后的正常人眼球，眼球供体年龄限制在24—38岁。 ***细胞的培养及标记采用胰蛋白酶消化法。用含有终浓度为40ug／mlSR的生长液孵育第3～5代生长至90％融和的HRPE细胞36小时。 ***的提取及FITC标记室温下，于暗处用终浓度为10ug／ml的FITC液孵育以蔗糖密度梯度法提取的ROS1小时，然后以细胞培养液调整浓度为1× 10ml 4．乳胶微球的制备以细胞培养液调整浓度至1× 10ml。 5．吞噬动力学观察向每个培养孔K孔板)中加入1× 10ml的 FITC－ROS或 LB悬液Zrnl，进行孵育。分别在孵育sndnJ5minJ0ndn＊．sh。 3h、6h、12h、18h在4h、36h、48h的时候，将孵育液吸出，以 4℃的无血清＊＊＊M冲洗二次，以终止吞噬。采用双重荧光标记法，于上述相应的实验时间点，在荧光显微镜下以非选择性滤光片动态观察HRPE细胞的吞噬过程。 6．扫描及透射电镜经与ROS或LB孵育6h后，加人2．5％的戊二醛固定，备电镜观察。 7．细胞内CAMP浓度的检测实验组每个培养子(24 IL板)中力人 IX 10’ml－‘的 ROS或 LB 悬液IInl，对照组加人培养液Inil／孔进行孵育，终止吞噬的时间及方法同上。向终止反应后的HRPE细胞中加人无血清DMEM液 pH7．4乃00W孔，立即放人沸水中煮沸 3 dn。从每个孔中取上清液100ul备‘勺一队MP放射免疫检测。 8．统计学分析结果每个实验点至少重复3次，计算均值上标准差k土S人用 Student’s t检验，比较实验组与对照组数值，P＜0．05为统计学上有明显差异的标准。结果一月RPE细胞吞噬动力学检测结果： ·2· 1．特异性吞噬：孵育15min时，即观察到ROS结合于HRPE细胞表面，30ndn 时可见极少数的ROS被HRPE细胞摄人细胞内，之后的孵育过程中HRPE细胞结合及吞噬的ROS数目不断增加，至孵育18h和 24h刀RPE细胞对ROS的结合及吞噬分别达到饱和。 2．非特异性吞噬：孵育至***结合启动，6h摄人开始，在观察的48h内HRPE 细胞结合及吞噬的LB数目随时间延长而呈线性增加。二、吞噬不同阶段 HRPE细胞内 cAMP浓度hmol·Inl1)检测结果： 1．特异性吞噬：孵育 15min时 HRPE细胞内 cAMP浓度开始降低门．13。0． 17八P＜0．05人在15min－18h内各个时间点的c＊＊P浓度无差异(P＞0．05)，孵育 24hCAMP浓度再次降低，24h－36h内 CAMP 浓度无差异冲＞0．05人 48 h CAMP浓度值略有回升。 2．非特异性吞噬：与 LB孵育的 smin—12llHRPE细胞内 cAMP浓度与对照组无差异(P＞0．05)，12h一8h C。4MP浓度较对照组降低(P＜0．05)。结论 ***细胞特异性吞噬过程中结合及吞人的启动早于非特异性吞噬。 ***细胞特异性吞噬的结合及吞人均具有饱和性，非特异性吞噬无饱和性。 ***对HRPE细胞特异性吞噬吞人过程的维持致关重要，但不参与非特异性吞噬的直接调节。 ***的特异性吞噬过程伴随着CAMP浓度的降低。

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酶协同微生物发酵提高武夷岩茶香气物质的工艺研究

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作者：谢李玲福州大学

学位级别：硕士

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视网膜下液中ICAM-1含量与增殖性玻璃体视网膜病变关系的研究

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作者：金咏红中国医科大学

学位级别：硕士

前言增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是导致视网膜脱离手术失败的主要原因。近年来，对PVR的发病进行了大量的研究，这其中，细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的粘附作用是分子生物学领域中一个基本... 详细信息

前言增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是导致视网膜脱离手术失败的主要原因。近年来，对PVR的发病进行了大量的研究，这其中，细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的粘附作用是分子生物学领域中一个基本且重要的问题。形态学和免疫组化研究显示广泛的视网膜增殖膜形成起因于各种细胞的迁移和增殖，包括视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞和巨噬细胞。由于视网膜色素上皮细胞只有实现粘附后才能完成激活、迁移、增生等过程，因此，RPE细胞在异位的粘附是PVR形成中最重要的环节，细胞粘附是细胞移行和增殖的前提。目前，手术仍然是治疗PVR的主要手段。但手术并不能有效阻止细胞的迁移增生，甚至刺激其加重，导致PVR复发，所以，最好的方法是预防。细胞间粘附分子-1(Intercellular adhension molecule-1，ICAM-1)对细胞趋化游走起重要作用，而细胞趋化游走发生于PVR的早期阶段，如能在此阶段阻断它的活化，将会延缓PVR的进程，甚至防止其发生。通过对可溶性细胞粘附分子在PVR发生中作用的研究，可以使我们对PVR的免疫机制有更进一步的了解，为将来免疫干预的辅助治疗做准备。本文通过选择视网膜脱离伴不同PVR分级的患者，定量检测其视网膜下液(subretinal fluid，SRF)中ICAM-1的含量，同时以正常人玻璃体做对照，探讨ICAM-1在PVR发病中的作用，为今后更有效地防治PVR提供理论依据。材料和方法一、病例来源选择39例诊断为了源性视网膜脱离（rhe驯atogenous rehnddetachment，RRD）合并PVR的住院患者，根据PVR的国际分级标准将患者分为A人人山四级，本研究的 B人力组与PVR的B。C山级相对应（本研究PVR－D级患者均为D;级／组病例较少，未列人实验人二、标本采集 1．对照组正常玻璃体，共8例，来源于离体8小时之内，湿房保存的角膜移植取材后的正常成年人尸体眼球。 2．病例组视网膜下液，采集于经外路手术的视网膜脱离患者，术中冷凝后穿刺放液，抽取视网膜下液约0．5 ml，注人无菌试管中，被血液污染样品未列人本实验，所有标本均置一70℃冻存。 5、ICAM一的检测采用上海森雄科技有限公司提供的SICAM－1定量EIA试剂盒。将标准品倍比稀释8个浓度，并设空白对照，正常人玻璃体做实验对照，在490urn测出标准品及待测标本的吸光度值，绘出标准曲线，求出标本的 ICAM一二含量。四、统计学分析病例组与对照组以及病例组间的比较采用方差分析，不同病程的组间比较用t’检验。结果不同PVR分级患者视网膜下液中ICAM－l的平均浓度分别为 B组 7．484ngilnl人组 16．383ng／Inl对组 28．466n少血，对照组平均浓度为0．515n吵d，经比较均有显著性差异u＜队05人随着P＊R分级的加重，视网膜下液中IC＊M－1的浓度增高（P＜O．05人不同病程的组间比较，大于一个月的病例组与小于一个月 ·2·的病例组的平均浓度分别为30．267n矿M和8．452n吵Inl，经统计学分析，差异非常显著河＜O．005人讨论 PVR的形成是眼内对损伤的一种炎症及修复反应，包括炎症期、增生期和癫痕期。在PVR炎症修复中需通过细胞粘附分子介导的细胞直接接触而实现。ICAM一二是最重要的粘附分子之一，是免疫球蛋白超家族的一个成员。异常升高的ICAM－l可以促进细胞外基质对视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞等的分化、迁移、增生，并启动免疫反应及炎症愈合过程，导致纤维化。

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虎纹蛙皮肤分泌物活性肽的分离纯化及表征

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作者：刘华福州大学

学位级别：硕士

生物活性肽是一种自然界广泛存在的对机体有生理作用的活性物质。作为水生到陆生动物间的过渡态生物,两栖动物裸露湿滑的皮肤为了抵御外界有害环境的侵害能分泌大量结构不同、功能各异的生物活性肽。这些生物活性肽的种类、功能和数量... 详细信息

生物活性肽是一种自然界广泛存在的对机体有生理作用的活性物质。作为水生到陆生动物间的过渡态生物,两栖动物裸露湿滑的皮肤为了抵御外界有害环境的侵害能分泌大量结构不同、功能各异的生物活性肽。这些生物活性肽的种类、功能和数量与两栖动物的种属及其分布地域有关。目前从两栖动物皮肤分泌物中发现的活性肽具有多种生理功能,如抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、神经调节、免疫调节等。无尾目两栖动物青蛙和蟾蜍的皮肤分泌物是目前主要的研究对象,从中分离纯化得到的主要为抗菌肽和抗氧化多肽。我国研究者从高原滇蛙中分离得到了一系列由15-30个氨基酸残基组成的抗氧化多肽,并具有很强的抗氧化活性,这种新型的抗氧化系统被命名为“第三套抗氧化系统”。虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus,又名Rana rugulosa)属于蛙科,虎纹蛙属。在我国分布较广,从东南沿海到西南内陆都有分布,还见于南亚和东南亚一带。到目前为止,研究者只从印度虎纹蛙皮肤分泌物中获得一类抗菌肽,从越南虎纹蛙皮肤中提取得到了一种促胰岛素释放肽,而对于虎纹蛙皮肤分泌物中的抗氧化肽则无报道。本研究以分布于福建省福清市水稻田中的虎纹蛙为实验动物,通过电刺激法提取其皮肤分泌物,利用多种分离纯化手段和活性检测方法对其抗菌和抗氧化活性物质进行了研究,最终从其皮肤分泌物中获得一种抗氧化二肽,对其活性进行了表征,并初步探讨了其抗氧化机理。通过Sephadex G-50凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对虎纹蛙皮肤分泌物进行了分离纯化,利用纸片扩散法和DPPH自由基清除活力实验分别对其抗菌活性和抗氧化活性进行了追踪检测。研究发现,在分离纯化过程中虎纹蛙皮肤分泌物的抗氧化活性逐步增强,而抑菌活性则减弱,推测其原因可能为其皮肤分泌物中多组分协调发挥抑菌作用,分离纯化过程造成了某些活性组分丢失。最终从中分离得到了一个具有较强抗氧化活性的多肽,通过HPLC-ESI-MS/MS质谱分析,其分子量为277.10 Da,利用MaxEnt3和MasSeq软件分析得到其氨基酸序列为Lys-Met。通过二肽Lys-Met对ABTS·+、DPPH·、·OH和02-·清除力及还原力、金属螯合力实验发现,此二肽具有较好的抗氧化能力。对二肽Lys-Me、Met-Lys及氨基酸Lys、 Met的抗氧化活性进行对比发现,多肽抗氧化活性不但与其氨基酸组成有关,同时也受其序列的影响,并通过液体核磁共振方法对其抗氧化机理进行了初步的探讨。

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人视网膜色素上皮细胞吞噬过程中细胞内钙离子浓度的变化

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作者：安刚中国医科大学

学位级别：硕士

目的视网膜色素上皮(RPE)细胞具有复杂的结构和特殊的生理功能。它的吞噬功能对维持正常的视觉至关重要。该功能障碍时引起视细胞外节膜盘的堆积而导致严重的视网膜变性。国内外学者已经证实视网膜变性性疾病RPE细胞特异性吞噬功... 详细信息

目的视网膜色素上皮(RPE)细胞具有复杂的结构和特殊的生理功能。它的吞噬功能对维持正常的视觉至关重要。该功能障碍时引起视细胞外节膜盘的堆积而导致严重的视网膜变性。国内外学者已经证实视网膜变性性疾病RPE细胞特异性吞噬功能障碍而非特异性吞噬功能正常，但其机理未得到阐明，进一步探讨吞噬功能及其机制，将对这类疾病的预防和治疗带来希望。目前虽已知RPE细胞的特异性吞噬功能涉及腺体-受体相互作用，启动跨膜信号传导系统;但是关于跨膜信号传导系统在RPE细胞的特异性吞噬过程中所起的作用仍不十分清楚。为此我们选择信号传导通路中的一个信使分子钙离子作为研究对象。通过采取体外培养人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium，HRPE)，动态检测人视网膜色素上皮细胞特异性及非特异性吞噬过程中Ca浓度变化，明确Ca在HRPE的吞噬功能中所起的作用。材料与方法 1．材料来源：取自中国医科大学附属一院眼科角膜术后的正常眼球，眼球供体年龄限制在24-36岁。 ***细胞的培养及标记。采用胰蛋白酶消化法。 ***的提取和人RPE细胞色素颗粒的制备。用细胞培养液调整浓度至10ml。 ***细胞吞噬模型的制备。把1×10ml视杆细胞外节膜盘(rod outer segments，ROS)及色素颗粒分别加入到37℃孵育培养的正常HRPE细胞，在孵育的不同时间(5min-24h)终止吞噬反应。用双重荧光标记法检测HRPE细胞吞噬动力学。 5．细胞内钙离子浓度的检测：用荧光显微镜Fluo-3荧光负荷技术联合冷CCD计算机成像分析系统检测相应时间点的HRPE细胞特异性及非特异性吞噬时的Ca浓度。结果 1.特异性吞噬的启动明显早于非特异性吞噬。巧m初丑05结合于RPE 细胞表面，1 .sh色素颗粒才结合于RPE细胞表面。 2.特异性吞噬组(ROS组):细胞内钙离子在巧面n出现了一个突然升高的峰，并在吞噬过程中一直维持高峰。经统计学检验与静息状态下的钙离子浓度有明显差异(P0 .05)。结论 ***细胞特异性吞噬过程中结合及吞人的启动早于非特异性吞噬。 ***+参与特异性吞噬过程，对吞人过程的维持十分重要，但不参与 HRPE细胞非特异性吞噬的直接调节。说明特异性吞噬与非特异性吞噬在信号传导方面有着明显的不同。

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