检索结果-南通市图书馆

作者：李丽华山东大学

学位级别：硕士

据不完全统计,全世界的陆地面积中约有三分之一是干旱、半干旱土地,且该比例有逐年上升的趋势。干旱对全球农作物产量的影响在诸多自然逆境中居首位,其危害相当于其它自然灾害之和。因此,植物耐早机理相关研究及探索如何提高植物抗旱能... 详细信息

据不完全统计,全世界的陆地面积中约有三分之一是干旱、半干旱土地,且该比例有逐年上升的趋势。干旱对全球农作物产量的影响在诸多自然逆境中居首位,其危害相当于其它自然灾害之和。因此,植物耐早机理相关研究及探索如何提高植物抗旱能力长久以来都是科学家关注的热点之一。从分子水平上阐明植物抗旱性的物质基础及其生理功能,从而通过基因工程方法创造耐旱新品种是植物抗旱性研究的一个重要领域。干旱胁迫对植物的影响广泛而深刻,可以影响到从种子萌发、营养生长和生殖生长,一直到开花结实;同时干旱还能影响到植物的诸多生理代谢过程,如光合作用、呼吸代谢、水分和营养元素的吸收转运、各种酶的活性和有机物质的转化、运输和积累等。植物抗逆生理上的适应主要有生物膜结构与功能的适应、渗透物质调节、抗氧化作用等等,而在分子水平则诱导了耐旱相关基因的表达。目前已知的,可以增强植物耐旱性的糖类物质主要是一些可溶性糖类,包括海藻糖、蔗糖、棉子糖系列寡糖及糖蛋白等,其抗旱作用机理主要是参与渗透调节、保护生物膜系统、清除氧自由基以及通过参与抗旱信号转导途径来调控相关基因的表达等。 GalE基因来源于大肠杆菌,该基因编码UDP-galactose-4-epimerase （EC5.***.3.2）,该酶在正常的代谢途径中催化由UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖的可逆转换。本工作以转galE基因T3代烟草作为研究材料,包括转正义基因和转反义基因株系,探讨了galE基因在提高烟草耐旱性方面的作用及其可能的作用机理。PCR及RT-PCR实验结果表明,galE基因稳定存在于转基因烟草中,并活跃表达。对转基因烟草在种子萌发阶段和幼苗期分别进行干旱胁迫处理,测定其抗旱相关的生理生化指标及该基因的表达变化,得到的主要实验结果如下：在含有相同浓度甘露醇的培养基上,转正义基因的烟草植株的种子萌发率高于转反义基因植株和未转基因对照植株。幼苗在200 mM和250 mM甘露醇的胁迫条件下培养,转正义基因株系的小苗可表现出比较明显的生长优势,并在根长和生物量方面都要显著优于转反义基因及对照株系小苗,表明转基因烟草中galE基因的表达提高了烟草种子萌发阶段及苗期的耐旱性。对9-11叶期的烟草植株进行干旱胁迫处理,分别于处理前、轻度萎蔫、重度萎蔫和恢复浇水后取材,分析目的基因的表达及其产物的变化情况,并测定光合作用相关参数、膜损伤参数、抗氧化保护酶系等生理指标。对galE基因的表达及表达产物活性进行检测,实验结果表明,干旱处理后galE基因表达活性随着萎蔫程度的加强而增强,且表达产物也表现出同样的趋势,表明该基因的表达与耐旱性紧密关联。进一步对胁迫前后植株进行光合系统参数分析,在光系统Ⅱ没有受损的情况下,正义株系L54在气孔导度、胞间CO2浓度及蒸腾作用等方面的指标都显著优于反义株系L23及对照株系WT;同时叶绿素含量也不断下降,光合速率和叶绿素含量导致光合功能衰退过程中,碳同化效率和光能转化效率失衡,使多余电子传递给氧而形成活性氧;比较三个株系的抗氧化保护酶系统中SOD和POD的活性,结果表明,株系L54的两个酶活性都有比较显著的优势,在主要的抗氧化保护酶SOD活性方面优势尤其明显,说明该基因在干旱胁迫条件下对烟草的抗氧化保护起到积极的作用;进一步的膜损伤测定结果表明,株系L54的离子渗漏要显著小于株系L23及WT的,产生的过氧化产物丙二醛也显著少于株系L23及WT的;在干旱胁迫下,植株脯氨酸含量有很大幅度的升高,株系L54的脯氨酸含量与未处理相比提高10.70倍。综合渗透势的变化及糖分含量的测定结果,可以确定L54株系在受到干旱胁迫后,通过维持细胞渗透势来抵抗干旱的能力要显著强于L23及WT株系。通过以上对干旱胁迫下转基因植株的基因表达及生理生化指标的分析可知,galE基因的正义表达能够提高转基因烟草植株的抗旱能力,推测其可能的作用机理是：galE酶催化生成的产物参与到渗透保护物质蔗糖的生物合成中;蔗糖进一步参与到半乳糖肌醇及棉子糖的合成过程中,半乳糖肌醇和棉子糖一方面可作为渗透调节因子发挥作用,另一方面可能起到保护植物细胞免受非生物胁迫引起的过氧化物分子的攻击;蔗糖还可能参与到了烟草的干旱胁迫应答反应中。

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玉米粗缩病7号染色体抗病位点的精细定位

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作者：李斌山东大学

学位级别：硕士

玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食兼饲料作物,在国民经济中占有非常重要的地位。玉米粗缩病(Maize Rough Dwarf Disease,MRDD)是一种广泛分布的病毒性病害,近年来在我国蔓延流行,造成了很大的危害,严重影响了玉米产量。充分利用已... 详细信息

玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食兼饲料作物,在国民经济中占有非常重要的地位。玉米粗缩病(Maize Rough Dwarf Disease,MRDD)是一种广泛分布的病毒性病害,近年来在我国蔓延流行,造成了很大的危害,严重影响了玉米产量。充分利用已有的抗性资源,定位和克隆粗缩病抗性基因,深入研究抗病机制是从根本上解决病害问题的有效途径。本实验室王飞利用掖478×90110的后代将玉米粗缩病的三个抗病位点定位到6、7、8三条染色体上。6号染色体抗病位点被定位到SSR标记umc1656和bnlg2191之间,7号染色体抗病位点被定位到SSR标记umc1401和umc1666之间,8号染色体抗病位点被定位到SSR标记bnlg1823和umc1268之间。在利用(掖478×90110)F群体构建的分子标记连锁图谱中umc1656和bnlg2191之间的遗传距离为4.5cM,umc1401和umc1666之间的距离为11.1cM,bnlg1823和umc1268之间的距离为5.8cM。根据(掖478×90110)F群体中玉米粗缩病抗病位点的定位结果,本工作选用了来自抗病自交系90110和感病自交系掖478杂交后代的重组自交系F038141和F072141为亲本,构建它们的F群体,即为定位群体。F038141和F072141在6号染色体位点均表现为感病基因型,用连锁标记umc1656检测时,电泳条带与掖478一致;在8号染色体位点均表现为抗性基因型,用连锁标记bnlg1823和umc1268检测时,电泳条带与90110一致;两者在7号染色体上的位点存在差异,前者表现为感病基因型,后者表现为抗病基因型。根据NCBI上提供的玉米基因组测序序列,在umc1401和umc1666之间设计SSR引物47对,筛选可在90110和掖478间以及F群体中表现出多态性的标记,其中13个SSR标记产生清晰的差异带,用于对定位群体进行SSR作图分析,最终将玉米粗缩病7号染色体上的抗病位点定位到SSR标记umc1401和L6之间的1.4cM的范围内,与umc1401和L6的遗传距离均为0.7cM。为了确定结果的可靠性,同时构建了90110与掖478的F群体在此区域的局部分子标记连锁图。用424对RAPD引物对抗病亲本90110,感病亲本掖478,F抗池,F感池DNA进行扩增,经过筛选发现在亲本间存在多态性的引物有257个,在亲本间没有多态性的引物有148个,无扩增产物和扩增条带极弱的有19个,多态率为58%。其中引物S217扩增的条带在两个亲本间存在多态性,并且此多态性与抗感、池的扩增结果相一致,差异带在340bp左右。测序结果表明这个片段全长329bp,位于4号染色体上BAC重叠群AC196110.4中,与预测基因FG14的部分序列及其随后的3’端序列匹配。该预测基因全长2151bp,由四个外显子和三个内含子组成,编码蛋白属于半胱氨酸蛋白酶抑制因子家族,编码蛋白全长184aa。利用生物信息学数据库maizesequence和NCBI的conserved domain程序找到了4个存在于定位区间umc1401和L6之内的可能性比较大的候选基因。其中AC203054.4的FG034含有抗病基因保守结构域核苷酸结合位点,AC206581.2的GRMZM2G131926含有两个抗病基因保守结构域丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和亮氨酸重复序列,AC196440.3的GRMZM2G094867属于Harpin诱导蛋白家族,AC225799.2的GRMZM2G100012属于细胞色素P450家族蛋白。根据已知的抗病基因的结构特征,这几个基因值得重点研究。另外,本工作研究了三重SSR引物反应体系,找到了一个适用于同时可进行三个玉米粗缩病抗病位点检测的反应体系,可应用于今后的分子标记辅助选择育种。本工作对玉米粗缩病7号染色体抗病位点进行了精细定位,筛选出部分候选基因,并研究了三重SSR引物反应体系,为今后的玉米粗缩病抗病基因克隆和分子标记辅助育种打下初步的基础。

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转基因聚合提高烟草耐旱性的研究

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作者：宋英杰山东大学

学位级别：硕士

目前,水资源短缺是公认的全球性环境问题之一。干旱对世界作物产量的影响,在诸自然逆境中占据首位,其危害相当于其他自然灾害之和。已报道的提高植物对非生物逆境抗性的基因工程大多数是通过将单个目的基因转入植物,获得的转基因植物抗... 详细信息

目前,水资源短缺是公认的全球性环境问题之一。干旱对世界作物产量的影响,在诸自然逆境中占据首位,其危害相当于其他自然灾害之和。已报道的提高植物对非生物逆境抗性的基因工程大多数是通过将单个目的基因转入植物,获得的转基因植物抗逆性提高水平仍有待提高。由于植物的耐旱性是受多基因控制的复杂遗传性状,依赖于多个基因之间的相互作用,因此,转入单个耐旱相关基因只能部分提高植物的耐旱性。一般认为,将多个耐旱相关基因聚合到同一植物中有可能会大大提高转基因植物抵抗干旱胁迫的能力。来源于大肠杆菌的betA基因,编码胆碱脱氢酶,转入植物后可提高细胞甘氨酸甜菜碱含量;来自于盐芥的TsVP基因编码V-H-PPase,该基因过表达可提高液泡膜逆浓度梯度转运离子的能力。已有的基因工程研究表明,分别过量表达这两个基因都可以明显改善植物的耐旱性。本工作以分别转betA基因烟草(BL)、转TsVP基因烟草(TL)和通过有性杂交方法获得聚合有betA基因和TsVP基因betA×TsVP(BT)烟草为材料,RT-PCR结果和甘氨酸甜菜碱含量检测以及V-H-PPase水解活性的测定结果都表明,两个转基因稳定存在于转基因聚合的烟草植株中,并活跃表达。对转单基因植株和转基因聚合植株在植株和细胞水平上进行了耐旱性分析,主要结果如下: 在加有甘露醇的培养基上,转基因聚合株系(BT)表现出比转单基因株系和未转基因对照株系较高的种子萌发率,表明转基因聚合相比转单基因提高了烟草在种子萌发阶段的耐旱性。四叶期的烟草小苗进行持续干旱胁迫,在未转基因WT植株大部分已经枯萎死亡时,转单基因株系和转基因聚合株系植株大部分仍然存活,且转基因聚合株系的存活率和存活植株的鲜重最高,但未达到差异显著。干旱胁迫处理后,转TsVP基因植株和转基因聚合植株比WT植株和转betA基因植株生长快,具有旺盛的地上部分和发达的根系,其中转基因聚合植株的生物量最高。在正常生长条件下,转TsVP基因植株和转基因聚合植株的净光合速率显著高于WT和转betA基因植株的,而TsVP转基因植株和转基因聚合植株之间以及WT和转betA基因植株之间在光合能力上没有显著差异。干旱胁迫处理导致所有株系植株的光合活性下降,但转基因植株的净光合速率和Fv/Fm都比WT植株的高,表明转基因植株在干旱胁迫下仍保持较高的光合效率。其它光合作用参数的测定结果也表明转基因植株在干旱胁迫条件下比WT植株具有更好的光合能力,但转基因聚合植株与转单基因植株相比差异不显著。干旱胁迫前后,转TsVP基因植株和转基因聚合植株的可溶性总糖的含量比WT和转betA基因植株要高,且转基因聚合的植株最高。在干旱胁迫之后,转基因聚合植株和转单基因植株比WT植株脯氨酸含量高,各转基因植株之间差异不显著。转基因聚合株系中较高的糖和脯氨酸含量以及低的渗透势有利于烟草植株在干旱胁迫下水分吸收和叶片的水分保持。干旱使膜系统受到伤害,导致不同株系植株的叶片MDA含量和细胞电解质外渗率大幅度升高。WT植株的MDA含量和细胞电解质外渗值最大,而转基因聚合植株的最小,表明WT植株细胞受到的伤害最重,而转基因聚合细胞受害程度最小。在细胞学水平上对渗透胁迫下细胞活力和线粒体膜完整性的测定结果得出同样的结论,即在相同的胁迫条件下,转基因聚合株系受害程度低,原生质体活力高和线粒体膜完整性好。利用pH敏感的荧光探针BCECF-AM结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测了渗透胁迫对叶肉细胞细胞质和液泡pH值的影响。在10%PEG处理下,无论是细胞质还是液泡,转TsVP基因和转基因聚合植株的细胞,pH变化幅度较小。根据能斯特方程计算跨液泡膜的质子电势(△Ψ(H))。在胁迫前和胁迫后,转TsVP基因细胞和转基因聚合细胞中的△Ψ(H)值都要显著高于未转基因的和转betA基因细胞的。以上结果表明在含有外源TsVP基因的细胞中,V-H-PPase通过水解PPi来酸化液泡,从而维持了细胞中高的跨液泡膜质子电势。使转基因植株细胞在胁迫环境下维持了相对稳定的内环境,从而提高转基因植株的耐旱性。

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转galE和lgtC基因烟草糖组分变化的初步研究

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作者：尹海英山东大学

学位级别：硕士

来自大肠杆菌的galE基因,编码UDP-galactose-4-epimerase（EC 5.***.3.2）,该酶在正常的代谢途径中催化由UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖的可逆转换。来自奈瑟氏脑膜炎球菌的lgtC基因,编码α-1,4-galactosyltransferase（EC 2.***.1.44）,该酶催化... 详细信息

来自大肠杆菌的galE基因,编码UDP-galactose-4-epimerase（EC 5.***.3.2）,该酶在正常的代谢途径中催化由UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖的可逆转换。来自奈瑟氏脑膜炎球菌的lgtC基因,编码α-1,4-galactosyltransferase（EC 2.***.1.44）,该酶催化半乳糖残基从供体分子转移到受体分子上。本工作利用分别转galE基因和lgtC基因的烟草植株研究细胞糖组分的变化,探求galE基因和lgtC基因对转基因植株代谢和生长发育的影响。为了准确测定转基因烟草叶片的可溶性总糖组成和含量,本工作利用薄层层析方法分离和鉴定转基因植株的各种糖分,同时采用高效液相色谱分离和示差折光检测器测定技术定量叶片提取液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量,采用反向高效液相色谱分离和光电二极管阵列检测器测定UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的含量。转galE基因烟草植株糖分测定以及galE酶活性分析本工作首先用RT-PCR方法筛选出galE基因高效表达的烟草转基因株系,然后对这些株系进行可溶性总糖、单糖和二糖以及核苷糖测定。在烟草酶提取液中加入底物UDP-葡萄糖后,反应液中出现产物UDP-半乳糖,即存在galE催化的反应。测定转基因植株的galE在不同条件下的酶活性,得出该酶在pH7-9之间具有活力,最适pH为7.5-8,最适酶反应温度约为20℃。转正义基因株系UDP-半乳糖的生成量是野生型对照和转反义基因株系的1.5-1.6倍。转基因烟草植株的糖分分析显示,转正义基因的株系E+41和E+54的可溶性总糖含量较对照株系显著提高,相应的葡萄糖、果糖和蔗糖含量与对照相比均有不同程度的提高;E+41和E+54的UDP-半乳糖含量与野生型相比显著提高,差异达到极显著（P≤0.01）;UDP-葡萄糖含量与野生型相比也显著提高。而转反义基因株系E-23的UDP-糖、可溶性总糖以及其它糖分含量均与野生型植株无明显差异。转基因植株生长发育观察和光合作用测定表明,向烟草中转入来源于原核生物的galE基因影响植株的生长发育和光合作用。对烟草种子萌发过程和植株生长发育各个时期的形态特征进行观察统计,结果发现,转正义基因植株在生长势方面明显优于野生型对照植株。与野生型对照植株相比,转正义基因植株幼苗具有更长的根系,在旺盛生长期具有更大的叶长、叶宽和叶面积,成熟期具有更高的植株高度,而且开花期相对较早。转正义基因植株的净光合速率明显高于野生型对照植株的。转反义基因植株在长势、开花期和净光合速率上均与野生型无明显差异。转lgtC基因烟草糖分的分析本工作采用RT-PCR技术选择出lgtC基因高效表达的转基因烟草株系,然后进行糖分测定,研究原核生物lgtC基因的引入对烟草植株体内糖组分及其含量的影响。糖分分析显示,转正义基因的株系C+27和C+43的可溶性总糖含量较野生型对照株系显著提高,其中葡萄糖、果糖和蔗糖含量与对照相比也有不同程度的提高;C+27和C+43的UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖含量较野生型均显著降低。而转反义基因株系C-32的可溶性总糖含量及葡萄糖、果糖、蔗糖的含量均与对照植株差别不大,但UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖含量与野生型相比均有降低。本论文分析了分别转galE和lgtC基因的烟草植株糖组分的变化,开展了原核生物糖代谢基因在植物基因工程中应用的尝试,探讨了糖代谢途径的遗传修饰对植株糖分积累和生长发育的影响。不仅为深入研究植物细胞糖代谢的调控机制鉴定出适宜的材料,而且为细胞糖代谢网络及其调控机制的揭示奠定了一定的工作基础,有重要的参考价值。

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农杆菌介导的黑麦草丛生芽芽尖的遗传转化及转基因植株再生

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作者：姜素云山东大学

学位级别：硕士

黑麦草是具有世界栽培意义的禾本科牧草和草坪草,其遗传转化常用的方法是基因枪法,此外有硅碳纤维介导法以及农杆菌介导法,受体体系一般是经离体培养获得的胚性愈伤组织、悬浮细胞系和原生质体。目前黑麦草遗传转化方法尚存在一些缺点,... 详细信息

黑麦草是具有世界栽培意义的禾本科牧草和草坪草,其遗传转化常用的方法是基因枪法,此外有硅碳纤维介导法以及农杆菌介导法,受体体系一般是经离体培养获得的胚性愈伤组织、悬浮细胞系和原生质体。目前黑麦草遗传转化方法尚存在一些缺点,如组织培养时间长、受基因型限制、愈伤组织经长期继代培养易出现体细胞无性系变异、转化周期长等,只从少数品种获得了少量的转基因植株。因此,建立一套高效、快速、不受基因型限制的黑麦草遗传转化体系是加快黑麦草基因工程发展的关键。本工作以优良黑麦草栽培品种海湾(一年生)、泰垂莱特(多年生)的黄化丛生芽的裸露芽尖分生组织作为遗传转化的受体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,将来自大肠杆菌编码胆碱脱氢酶的betA基因转入两种基因型黑麦草细胞中,获得了可育的转基因植株。研究了影响黑麦草芽尖转化效率的因素,优化了转化体系。具体内容如下: 黑麦草离体丛生芽培养体系的建立:以黑麦草无菌种子苗的茎尖生长点部分为外植体,在附加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D的诱导培养基上诱导丛生芽发生,在附加2.0mg/L 6-BA的增殖培养基上继代培养,建立起高效的黑麦草丛生芽离体培养体系。黑麦草丛生芽芽尖的遗传转化:取在增殖培养基上培养8-10天的丛生芽块剥成1mm大小的单芽或小芽块,尽可能地裸露出生长点,在携带质粒pCAMBIA1300-betA-als的农杆菌LBA4404浸染液中(加入0.1mmol/L乙酰丁香酮)浸染,同时在0.5×10Pa负压下处理5min,无菌滤纸略吸小芽块上的残留菌液后,于丛生芽增殖培养基上共培养3天,然后转移到加有100mg/L头孢霉素的抑菌培养基上培养8天,再转移到加有3-5mg/L绿磺隆的筛选培养基上连续筛选3代,每代15天。存活的小芽在无除草剂的培养基上恢复培养后,转入生根培养基,20天后,移栽入上层蛭石、下层壤土的花盆中。2个月后对移栽成活植株进行PCR检测,确定转基因植株。研究了影响黑麦草遗传转化效率的因素,优化了转化条件,以继代培养8-10天的丛生芽为受体,浸染液浓度OD为0.5,加入0.1mmol/L乙酰丁香酮,在0.5x10Pa负压下浸染5min,抗性芽比例较高,最高达到32.7%。该转化体系以黄化丛生芽裸露芽尖为转化受体,基因型依赖性小,仅需3-4个月即可获得转基因植株,且转化效率较高,这为黑麦草基因工程育种打下了良好的基础。

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转ipt基因及细胞工程草地早熟禾的抗逆性分析

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作者：王婷婷山东大学

学位级别：硕士

草地早熟禾（Poa pratensis L.）属冷季型草坪草,是温带地区重要的草坪草种之一。它具有色美、耐荫、耐修剪、耐践踏等优点,能形成稠密的草皮,常用于草坪和绿地的建植中,但它也具有不耐炎热、抗旱力不强等缺点。由于草地早熟禾多采用兼... 详细信息

草地早熟禾（Poa pratensis L.）属冷季型草坪草,是温带地区重要的草坪草种之一。它具有色美、耐荫、耐修剪、耐践踏等优点,能形成稠密的草皮,常用于草坪和绿地的建植中,但它也具有不耐炎热、抗旱力不强等缺点。由于草地早熟禾多采用兼性无融合方式繁殖,采用常规的育种方法培育新品种受到很大的限制。植物细胞工程和基因工程技术的发展为提高草地早熟禾品种的抗逆性提供了一条新途径。转ipt基因草地早熟禾的获得及耐冷性分析异戊烯基转移酶（isopentenyl transferase,IPT）是细胞分裂素合成途径的限速酶,过量表达ipt基因的转基因植株表现为细胞分裂素（CTK）含量增加,叶片衰老延迟。本工作以草地早熟禾无菌种子苗茎尖为材料,在附加适宜浓度6-BA和2,4-D的培养基上诱导丛生芽发生并继代培养,建立起了高效的丛生芽离体培养体系。然后以丛生芽芽尖为受体,利用根瘤农杆菌（菌株LBA4404,携带mini-Ti质粒pCAMBIA1300-ipt-bar）介导法将来源于根瘤农杆菌的ipt基因转入3个草地早熟禾优良品种中,经增殖后,移栽至花盆。对转化植株进行PCR和Southernblotting检测证实,ipt基因已转入草地早熟禾中。对转ipt基因的草地早熟禾和对照株系进行分蘖数比较,得出转正义ipt基因株系的分蘖数明显高于非转基因株系的,转反义株系的与对照植株差异不大。对离体叶片在不同条件下进行褪绿实验也发现,转正义基因株系的持绿性优于对照株系。将离体叶片在4℃下进行褪绿试验,发现转正义ipt基因植株叶片的持绿时间明显长于非转基因植株和转反义的植株的,而非转基因植株与转反义基因植株之间显差不明显。在济南自然过冬条件下,对转正义ipt基因株系和各自的未转基因对照品种进行耐冷性比较分析。植株形态观察表明,转正义基因植株具有明显提高的耐冷性,持绿期较长。生理指标测定表明,在10℃/1℃（昼/夜）温度下,转基因植株和对照植株的差异不显著;随着气温的降低,与对照植株相比,转基因植株出现冻害表型的时间晚,细胞膜受损伤程度低,叶绿素含量较高,即转基因植株比对照有更好的持绿性;在-8℃处理5天后,转基因植株也受害较轻,丙二醛含量和离子渗漏率较低。并且不同转基因株系的耐冷性存在明显差异,其中部分株系表现出比对照品种显著提高的耐冷性,具有很好的应用前景。草地早熟禾细胞工程植株的耐热性分析本实验室以继代培养的草地早熟禾丛生芽芽块为材料,经过49℃热胁迫处理和对存活株的选育,获得了一批耐热株系。本工作对这些通过细胞工程途径获得的耐热株系进行了耐热性分析。细胞工程植株和对照植株移栽到纸杯中,放于23℃下生长,选取生长状态一致的植株分别进行46℃5小时和40℃3天的热胁迫处理,并进行相关生理指标的测定。经46℃5小时的热胁迫处理后,各株系叶片的丙二醛含量和离子渗漏率都升高,但经过耐热筛选株系的升高幅度低于对照株;叶绿素荧光和叶绿素含量的测定结果也说明对照株光合系统受损较严重。即经过耐热筛选的株系具有提高的耐热性。对各项生理参数的测定还发现,各生理指标对热胁迫应答的速率及反应强度不同,叶绿素荧光对热胁迫最为敏感。经40℃3天热胁迫处理的株系,损伤程度大于46℃5小时热胁迫植株的损伤程度。叶绿素荧光和存活率的测定表明,细胞工程株系除N55株系外,其余均表现出较高的耐热性。本工作分别通过基因工程和细胞工程的方法对草地早熟禾优良品种进行了改良,为培育强抗冷性、持绿期长和耐热性好的新品种提供了优异材料,可促进草地早熟禾种植区域的扩大和提高草坪质量,有着广阔的应用前景。

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转ZmPIS基因提高高羊茅耐旱耐盐性研究

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作者：徐国荣山东大学

学位级别：硕士

干旱与盐害严重影响植物的生长发育,造成作物的生长缓慢甚至死亡。植物在进化过程中形成了对干旱和盐害应答的复杂机制,通过多种信号途径来做出相应的抗逆反应。研究表明,磷脂酰肌醇信号途径(phosphatidylinositol pathway)在植物生长... 详细信息

干旱与盐害严重影响植物的生长发育,造成作物的生长缓慢甚至死亡。植物在进化过程中形成了对干旱和盐害应答的复杂机制,通过多种信号途径来做出相应的抗逆反应。研究表明,磷脂酰肌醇信号途径(phosphatidylinositol pathway)在植物生长、发育和对环境胁迫应答过程中发挥重要的作用。磷脂酰肌醇合成酶(phosphatidylinositol synthase,PIS)以CDP-DG和myo-inositol为底物生成磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PtdIns),磷脂酰肌醇是真核细胞中主要磷脂成份之一,也是细胞中主要磷脂信号分子的前体。高羊茅(Festuca arundinacea Schreb)是异源六倍体的多年生冷季型牧草和草坪草,以其适应广泛,耐寒性强,耐热性好,抗病性强等优点成为倍受青睐的优质草种。本工作将从玉米中克隆的ZmPIS基因导入高羊茅植株,以转基因植株为材料分别进行干旱控水胁迫试验和盐胁迫试验,测定抗逆相关生理指标,分析通过ZmPIS基因转入提高高羊茅抗逆性的可能性,希望获得抗逆性显著提高的高羊茅育种新材料。本工作首先对转ZmPIS基因(正义和反义)的高羊茅进行PCR检测和Southern杂交,证明了ZmPIS基因已经整合到高羊茅基因组中,获得了稳定的转基因高羊茅植株。然后以切成单芽的转ZmPIS基因和非转基因对照高羊茅无菌小苗为材料,在添加甘露醇和NaCl的培养基上培养。结果表明,转正义ZmPIS基因小苗的生长状态和增殖能力显著优于对照,而转反义ZmPIS基因小苗与对照相比差异不显著。对盆栽高羊茅植株进行了耐旱耐盐性分析,从3个基因型的转基因株系中各选择4个株系(3个转正义ZmPIS基因株系,1个转反义ZmPIS基因株系)和未转基因对照株一同进行胁迫处理。在干旱胁迫条件下,多数转正义ZmPIS基因植株的生物量和生长表型要明显优于对照的,并且转正义基因植株的相对含水量和叶绿素含量较高,细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻,而转反义ZmPIS基因植株与对照相比差异不显著,可能是转正义基因植株具有较低的细胞溶质势从而使植株受干旱胁迫程度较轻。在进行盐胁迫时,由于环境温度比较高,所以在用含350 mmol/L NaCl的Hoagland营养液浇灌15天后,转反义ZmPIS基因植株和对照植株的地上部分基本都已干枯变黄,而部分转正义ZmPIS基因株系花盆内仍有较多分蘖存活,并且多数转正义基因植株的脯氨酸含量和叶绿素含量比对照植株高,丙二醛含量比对照低,但转反义ZmPIS基因植株与对照相比差异不显著,可能是转正义基因植株细胞内积累了较多的溶质(脯氨酸等),利于细胞对水分的吸收,从而降低了盐胁迫的伤害程度。综上所述,通过对转基因高羊茅和对照植株的耐旱耐盐性测定,可以得出将玉米ZmPIS基因导入高羊茅,能够明显提高转基因高羊茅的耐旱和耐盐性,创造出了能抗御干旱、高盐的高羊茅新种质。并且,该工作为探讨渗透胁迫和磷脂酰肌醇信号传导途径的关系提高具有重要价值的资料。

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susA、galE和lgtC基因转入烟草及转基因植株糖分分析

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作者：张艳芳山东大学

学位级别：硕士

植物作为生物反应器具有许多微生物、动物细胞培养系统所不具备的优点：1)可对真核蛋白进行正确的翻译后加工，形成有活性的分子：2)不需要复杂的发酵产物后提取和分离、纯化过程：3)可利用自身丰富的底物，生产成本相对低廉;4)不涉及... 详细信息

植物作为生物反应器具有许多微生物、动物细胞培养系统所不具备的优点：1)可对真核蛋白进行正确的翻译后加工，形成有活性的分子：2)不需要复杂的发酵产物后提取和分离、纯化过程：3)可利用自身丰富的底物，生产成本相对低廉;4)不涉及公众目前非常关心的有关转基因动物伦理道德的问题和产品病毒污染等问题。因此，转基因植物将成为一种新的潜力巨大的生物反应器。迄今为止，已有大量的有关利用植物生产活性蛋白用于医药、食品、工业等领域的可行性文献，也有利用植物生产高附加值碳水化合物和脂类的报导。植物通过光合作用在叶中合成糖类物质，然后从叶中转移到根、(块)茎、籽粒等贮存器官中，采用遗传改良方法改变植物组织的糖代谢途径，有可能使植物成为生产高附加值寡糖、多糖和糖蛋白的生物反应器。 Globotriose是一种具有重要价值的寡糖。在大肠杆菌中，它的合成需要3个关键酶基因：1) susA，编码Sacrose synthase(EC2.***.1.13);2) galE，编码UDP-galactose 4-epimerase(EC 5.1-3.2);3) lgtC，编码a-1，4-galactosyltransferase(EC 2.4.1.x)。在植物中Globotriose因缺少这三种酶而不能被合成。本工作拟将上述基因转入模式植物烟草，探讨利用转基因烟草合成Globotriose的可能性。首先将上述基因分别正、反向克隆到植物表达载体pCAMBIA1300-35S-Tnos-als的KpnI位点，共得到6个重组质粒plgtC(+/-)、pgalE(+/-)和psusA(+/-)。用携带上述质粒的农杆菌转化烟草无菌苗叶盘，在加有选择剂的培养基上筛选后获得转化植株。对转化植株进行PCR检测和Northern杂交鉴定，证明外源基因已转入烟草并活跃表达。对转基因烟草植株的可溶性总糖分析发现，转正义susA基因的烟草植株可溶性糖含量比对照植株有一定提高，在检测的4个株系中，除1个差异不显著外，其余3个株系均达差异显著水平(P≤0.05)：这3个株系间可溶性糖含量虽有差异，但差异不显著。转反义susA基因的烟草株系，其可溶性糖含量与对照株系相比，除1个差异不显著外，其余3个株系均极显著(P≤0.01)提高。转正义galE基因的5个株系中有2个株系可溶性糖含量较对照有明显提高，差异极显著(P≤0.01)：1个株系可溶性糖含量与对照相比显著提高，达到差异

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利用分子标记技术改良玉米粗缩病抗性

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作者：李玉杰山东大学

学位级别：硕士

玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease, MRDD)是严重危害玉米生产的一种世界性病毒病,近年来在我国华北和黄淮海地区蔓延流行,造成了很大的危害。在我国,玉米粗缩病病原为水稻黑条矮缩病毒,传毒媒介为灰飞虱。我国玉米育种工作者在多... 详细信息

玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease, MRDD)是严重危害玉米生产的一种世界性病毒病,近年来在我国华北和黄淮海地区蔓延流行,造成了很大的危害。在我国,玉米粗缩病病原为水稻黑条矮缩病毒,传毒媒介为灰飞虱。我国玉米育种工作者在多年的玉米粗缩病抗性鉴定中,筛选出一批抗粗缩病的玉米材料,如90110等,但生产上所用的骨干自交系及杂交种一般粗缩病抗性差。充分利用已有的抗性资源,通过分子标记辅助选择培育高抗粗缩病的自交系及新品种成为当前亟待解决的问题。本实验室王飞等利用SSR-BSA技术找到了与玉米粗缩病抗病位点连锁的分子标记,并在F2群体和重组自交系群体中分别对抗病位点进行了初步定位,将三个抗病位点(Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3)分别定位到6、7、8三条染色体上。这为利用分子标记辅助选择技术进行玉米粗缩病抗性育种打下了坚实的基础。在本工作中,以抗病自交系90110为供体亲本,以感病玉米自交系掖478、昌7-2、郑58、DH4866、9801、L189、917、L62、8723、5003、502、65232等为受体及轮回亲本,通过杂交和多代回交将90110携带的抗病位点导入到这些自交系中,使其在保持原有优良性状的同时获得粗缩病抗性。在这个过程中采用分子标记辅助选择技术对回交群体进行选择,从而保证入选植株携带目标基因,并通过背景选择缩短育种进程。在前景选择的同时,对入选的回交一代、回交二代、回交三代植株、轮回亲本和90110在同样条件下进行玉米粗缩病抗性田间鉴定。结果表明：抗病亲本90110中没有发生粗缩病,掖478、昌7-2、郑58、DH4866、8723、9801等自交系均有不同程度发病;通过分子标记辅助选择得到的植株,除个别外,其抗性要显著高于其轮回亲本,表现为抗病。即抗病基因存在于中选植株中。对前景选择入选的植株进行农艺性状的考察,与轮回亲本进行比较,将相似度比较高的个体用作下一代回交群体的亲本,并继续进行分子标记辅助选择。经过三代回交、选择后,入选植株和轮回亲本十分接近,但一些多基因控制的性状如叶长、叶宽、株高、雄穗分支数等在入选植株后代和轮回亲本之间往往仍存在差异。根据实验室已构建的掖478×90110的遗传图谱,平均选取覆盖玉米10条染色体的50个SSR标记对15棵掖478BC3F1植株、17棵掖478BC2F2植株进行全基因组背景扫描,计算背景回复率。理论上通过三代回交植株平均背景回复率为93.75%,但在上述两个群体中,背景回复率的平均值均低于理论值。这可能是由于抗病位点分布在三条染色体上,需要同时对三条染色体进行前景选择,入选植株连锁累赘程度较严重,保留了较多供体染色体上的缀余片段。与回交二代植株相比较,回交三代植株的遗传背景更接近于轮回亲本,,因此,要导入分布在3条染色体上的不同基因,即便采用分子标记辅助选择,杂交植株至少要回交3代,才能获得和轮回亲本基本一致的个体。本研究的意义有：1)首次利用分子标记辅助选择技术改良我国玉米骨干自交系的粗缩病抗病抗性,且获得成功,对已有的材料只要再进行一代自交和选择,就可为玉米育种提供一批高抗粗缩病的优良玉米自交系。2)建立了玉米粗缩病分子标记辅助育种的技术体系,这对于我国玉米育种技术的提高有重要推动作用。3)为采用分子标记辅助育种技术向玉米优良基因型导入多个目标基因提供了成功实例和参考资料。

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玉米苗期耐盐性的QTL定位

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作者：吴丹丹山东大学

学位级别：硕士

盐胁迫是影响玉米生长的重要因素,而作物的耐盐性是一种由多个基因控制的数量性状。本研究以耐盐亲本F63和感盐亲本F35杂交后代单粒播种构建F2：5RIL (recombination inbred line)群体,共161个家系。利用这161个家系的DNA测定高质量的SN... 详细信息

盐胁迫是影响玉米生长的重要因素,而作物的耐盐性是一种由多个基因控制的数量性状。本研究以耐盐亲本F63和感盐亲本F35杂交后代单粒播种构建F2：5RIL (recombination inbred line)群体,共161个家系。利用这161个家系的DNA测定高质量的SNP标记,并用ICimaping3.3软件构建高密度的遗传连锁图谱。用温室水培系统和盐池这两个环境培养该RIL群体,作为本次实验的材料。温室水培条件下,用160mmol/L的NaCl对三叶一心期幼苗处理七天,测定地上部各种耐盐指标,包括耐盐指数(STR),鲜重(SFW),干重(SDW),组织含水量(TWC),地上钠离子含量(SNC)及钾离子含量(SKC),钠钾比值(SNC/SKC)。盐池条件下,主要测定其出苗率(FGR)以及耐盐指数(FSTR)。这些表型数据再分别用QGAstation进行条件分析,得到条件值后用于之后QTLnetwork2.1的分析,通过QTLnetwork2.1进行QTL计算,共找到9个条件加性QTL，20个加性QTL,其中12个与处理有互作,9个上位性QTL,其中2个与处理有互作。在盐池条件下,通过FGR和这FSTR这两个表型数据,分别检测到一个加性QTL, QFgr1、QFstr1,且这两个QTL在染色体上共连锁,分别解释高达30.43%和58.33%的表型变异。通过STR这一表型,共检测到3个加性QTL,分别为QStr1、QStr3、QStr7,分别解释14.25%、24.98%及3.37%的表型变异。通过TWC这个表型,则检测到了4个加性QTL,2对上位性QTL及1个条件加性QTL。这4个加性QTL分别为QTwc1、QTwc3、QTwc7、QTwc9,分别解释1.65%、11.65%、2.41%、4.19%的表型变异,且都与处理有互作,分别解释表型变异的6.97%、10.11%、2.15%及3.85%;2对上位性QTL分别为QTwc1/QTwc3和QTwc3/QTwc9,分别解释表型变异的0.10%、1.41%;1个条件加性QTL为QTwcs|twcn3,解释表型变异的27.12%。对于SNC这个表型,共找到了2个加性QTL、1对上位性QTL和1个条件加性QTL。两个加性QTL分别为QSnc3和QSnc5,分别解释表型变异的4.33%和4.37%,并且这两个QTL都与处理有互作,分别解释7.59%和4.05%的表型变异;1对上位性QTL为QSnc1/QSnc6,解释4.85%的表型变异;1个条件QTL为QSncs|sncn3,解释10.86%的表型变异。对于SKC,一共得到4个加性QTL和5个条件加性QTL。4个加性QTL分别为QSkc3、QSkc5、QSkc7和QSkc9,分别解释表型变异的15.43%、8.22%、4.36%和5.43%。其中QSkc3和QSkc5这2个加性QTL与处理有互作,分别解释16.24%和1.81%的表型变异;5个条件加性QTL分别为QSkcs|skcn1、QSkcs|skcn3.1、 QSkcs|skcn3.2、QSkcs|skcn4和QSkcs|skcn5,分别解释表型变异的12.85%、49.07%、47.96%、7.11%和4.67%。通过SKN,一共获得了5个加性QTL3对上位性QTL,2个条件加性QTL。5个加性QTL分别为QSkn3、QSkn4.1、QSkn4.2、QSkn5和QSkn6,分别解释2.32%、16.81%、16.85%和1.21%和1.17%的表型变异。其中QSkn3、QSkn4.1、QSkn4.2、 QSkn5这4个QTL与处理有互作,分别解释表型变异的2.29%、25.07%、24.88%和0.98%;3对上位性QTL分别为QSkn4.1/QSkn6、QSkn5/QSkn6和QSkn6/QSkn10,分别解释表型变异的0.58%、0.79%和0.76%;2个条件加性QTL分别为QSkns|sknn3和QSkns|sknn5,分别解释32.54%和9.28%的表型变异。

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