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胃铋镁对胃癌的防治作用及其相关信号通路研究

胃铋镁对胃癌的防治作用及其相关信号通路研究

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作者：乔巍东北师范大学

学位级别：硕士

胃癌是全世界最常见的消化道肿瘤之一,已成为我国第二大致死癌症,然而目前尚无有效的治疗药物。有研究显示,慢性萎缩性胃炎和胃溃疡与胃癌的关系最为密切,是胃癌发生的危险因素。对萎缩性胃炎具有显著疗效的药物,特别是多靶点的组方药... 详细信息

胃癌是全世界最常见的消化道肿瘤之一,已成为我国第二大致死癌症,然而目前尚无有效的治疗药物。有研究显示,慢性萎缩性胃炎和胃溃疡与胃癌的关系最为密切,是胃癌发生的危险因素。对萎缩性胃炎具有显著疗效的药物,特别是多靶点的组方药物可能具有预防和治疗胃癌的潜在功能。针对已有胃炎和胃溃疡的组方药物进行胃癌疗效的探索和扩展研究,可能是胃癌药物研发的新途径。胃铋镁颗粒是弘美制药中国有限公司研发的具有自主知识产权的国药准字号药物,对临床上各种胃炎和胃溃疡以及胃黏膜损伤有很好的疗效。胃铋镁颗粒属新型化药中药结合制剂,化药组方包括铝酸铋、重质碳酸镁和碳酸氢钠,中药组方包括甘草浸膏粉、弗朗鼠李皮、茴香粉、石菖蒲和芦荟。胃铋镁颗粒对胃炎和胃溃疡的有效性和其组方的多样性,提示药物通过多靶点调控细胞信号,具有很强的胃癌药物研发潜质。因此,本论文研究了胃铋镁对胃癌细胞功能的影响,筛选了胃铋镁的有效单药组分,并探究了胃铋镁抗肿瘤作用的分子机制。首先,我们研究了胃铋镁对胃癌细胞活力和细胞周期的影响。以三联药(三种市售胃炎胃溃疡类药物联合用药)、胃铋镁、胃铋镁-中药总组分、胃铋镁-化药总组分为实验组,分别作用于胃癌细胞SGC-7901,MTT法检测细胞的增殖状态。根据胃铋镁的IC(100μg/ml),确定了实验组各药物浓度,并利用这一浓度进行后续细胞生物学实验。结果显示,相比于对照组和三联药组,胃铋镁能够显著抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖,并且具有剂量依赖效应。利用Hoechst33342和CalceinAM/PI染色实验,我们检测了胃铋镁对胃癌细胞凋亡的作用,发现胃铋镁显著增加了凋亡百分数,降低了活死细胞比例,表明胃铋镁能够显著促进胃癌细胞的凋亡,并表现出显著的肿瘤杀伤作用。我们又通过流式细胞术检测,发现胃铋镁可以使胃癌细胞阻滞在G1期;此时,细胞周期蛋白Cyclin A、B、D、E的表达均明显减少。结果提示胃铋镁具有显著的抗肿瘤作用。在实验中我们还发现,胃铋镁对胃癌细胞的作用主要来自于中药组分,化药组分的药效不显著。我们进一步探讨了胃铋镁中对肿瘤具有杀伤效应的有效单药组分。由于上述实验中,胃铋镁中药总组分显示出了良好的抗肿瘤作用,而化药组分作用不显著,所以我们对中药组分中的五味中药进行了筛选。重复上述细胞生物学实验,结果显示弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲能够显著抑制胃癌细胞的增殖、诱导胃癌细胞凋亡,并且它们均能将胃癌细胞阻滞在G1期,而这些作用在在另外两种单药甘草、芦荟组中不显著。结果表明,弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲这三种药物是胃铋镁发挥抗肿瘤作用的主要活性成分。胃癌发生发展过程中,与多种信号通路相关联。大量研究数据表明,异常活化的STAT3信号增强了肿瘤的抗凋亡抗耐药能力,促进了肿瘤的侵袭、转移及血管新生。STAT3信号的异常活化贯穿于胃癌发生发展的始终,所以我们研究了胃铋镁及其有效组分对STAT3信号通路的影响。我们通过双荧光素酶报告基因实验检测发现,胃铋镁及其有效组分能够抑制STAT3转录活化STAT3-Luc荧光素酶报告基因的表达。同时Western Blot实验表明,胃铋镁及其有效组分能下调STAT3和P-STAT3的表达,说明胃铋镁及其有效组分可以抑制STAT3激活。研究发现,STAT3的下游靶基因也与胃癌的发生发展有着密不可分的关系,所以我们通过Western Blot实验检测STAT3的下游靶基因的表达情况。cyclinD1的主要功能是促进细胞增殖和分裂,推动细胞由G1期进入到S期,干扰cyclinD1的表达可以使胃癌细胞阻滞在G1期,本研究实验结果表明胃铋镁及其有效组分与对照组相比,cyclinD1的表达显著减弱。Bcl-2基因在细胞凋亡过程中发挥关键作用,具有抑制细胞凋亡的功能,本研究发现,胃铋镁及其有效组分能够显著下调Bcl-2的表达,促进细胞凋亡。c-myc基因和Survivin均可以促进细胞增殖,我们的实验结果也表明胃铋镁及其有效组分可以显著抑制c-myc和Survivin基因的表达。上述结果说明,胃铋镁及其有效组分能够通过调节stat3信号通路发挥抗肿瘤作用。在体外试验中,胃铋镁及其有效组分显示出了良好的抑制肿瘤增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用,所以为了探究这几种药物在体内的作用效果,我们构建胃癌细胞SGC-7901裸鼠荷瘤模型,研究胃铋镁及其有效组分对胃癌异位瘤的生长抑制作用。结果显示,胃铋镁组、弗朗鼠李皮组、茴香组和石菖蒲组肿瘤的大小明显小于三联药组和生理盐水组,说明胃铋镁在体内具有显著的抑制肿瘤生长的作用。接着我们对裸鼠的肿瘤进行包埋与切片,并通过免疫组化实验检测了STAT3信号通路相关蛋白STAT3、P-STAT3、Bcl-2、CyclinD1和Survivin的表达情况。结果显示,与生理盐水组和三联药组比较,胃铋镁组、弗朗鼠李皮组

关键词：胃癌胃铋镁 STAT3信号

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神经胶质成熟因子beta (GMFβ) 在小鼠脑积水病理条件下的表达分析

神经胶质成熟因子beta (GMFβ) 在小鼠脑积水病理条件下的表达分析

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作者：石健东北师范大学

学位级别：硕士

前期实验工作通过基因芯片技术初步检测野生型正常小鼠、AQP4敲除正常小鼠和AQP4敲除自发脑积水小鼠的大脑组织中基因群的表达差异,筛选出可能相关基因,为进一步深入研究脑积水病理过程提供新线索。其中神经胶质成熟因子beta(GMFβ)的m... 详细信息

前期实验工作通过基因芯片技术初步检测野生型正常小鼠、AQP4敲除正常小鼠和AQP4敲除自发脑积水小鼠的大脑组织中基因群的表达差异,筛选出可能相关基因,为进一步深入研究脑积水病理过程提供新线索。其中神经胶质成熟因子beta(GMFβ)的mRNA水平在脑积水病理条件下比正常情况下调最为明显,预示其可能是一种参与脑积水病理过程相关的蛋白因子,需要进一步深入研究。应用RT-PCR技术,从成年CD1小鼠大脑总RNA中获得GMFβ基因编码区全长DNA序列,将此序列克隆入GST融合蛋白原核表达载体pGEX-2T,成功构建重组表达质粒pGEX-2T-GMFβ;转化大肠杆菌***21/DE3,用IPTG大量诱导GST融合蛋白表达,优化表达和提取条件以提高上清可溶性蛋白含量,使用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B进行亲和纯化,免疫兔子得到多克隆抗血清,经ELISA和免疫组化鉴定抗体的效价和特异性较好;进行RT-PCR和免疫印迹检测,半定量分析脑积水小鼠(AQP4-/-,spontaneous hydrocephalus)大脑组织的GMFβ表达比正常小鼠(***.和AQP4-/- nor.)减少,与基因芯片检测结果基本一致。

关键词：神经胶质成熟因子-β(GMFβ) 脑积水水通道蛋白AQP4

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(Fe3O4@SiO2)/（PDDA/PSS）_n/（CdS/PAMAM）磁性荧光纳米粒子的制备与性能研究

(Fe3O4@SiO2)/（PDDA/PSS）_n/（CdS/PAMAM）磁性荧光纳米粒子的...

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作者：王珂北京理工大学

学位级别：硕士

磁性荧光双功能纳米颗粒由于其荧光可示踪性、磁响应性以及在纳米尺度的特性,在细胞分离与成像,药物标记和疾病诊断等生物医药领域得到了广泛的应用。一直以来,制备结构明晰、磁性与荧光性能优异且相互间无影响的双功能体系是研究者所... 详细信息

磁性荧光双功能纳米颗粒由于其荧光可示踪性、磁响应性以及在纳米尺度的特性,在细胞分离与成像,药物标记和疾病诊断等生物医药领域得到了广泛的应用。一直以来,制备结构明晰、磁性与荧光性能优异且相互间无影响的双功能体系是研究者所关注的一个焦点。高温分解法较传统的共沉淀法,在制备磁性氧化铁纳米粒子时具有产物形貌规则,粒度分布均一,结晶性能良好,饱和磁化强度大等优点,得到越来越多研究者的青睐;但由于制备的纳米粒子为疏水配体所稳定,需要进经过一定的修饰转入水相方可应用,而二氧化硅材料作为一种生物相容性较好的材料可满足其转相的需求;同时,利用硅层负电性易于进行静电吸附从而使其进一步功能化。利用静电层层自组装法(LBL)制备双功能纳米材料可对颗粒尺寸分布、形状以及壳层组成等方面进行精确控制,故而在磁性荧光双功能纳米颗粒的制备方面崭露头角。本文以高温分解法制备的Fe3O4纳米粒子为磁核,对其进行反相微乳液法的SiO2包覆以赋予其水溶性,利用硅层的负电性进行了聚电解质PDDA、PSS的层层自组装,最外层结合带正电的树形分子为模板的CdS/PAMAM量子点,从而制备了磁性荧光双功能复合纳米颗粒。对磁性Fe3O4纳米粒子的制备、二氧化硅包覆结果进行了多方面的表征及影响因素研究,对自组装过程进行了验证并探究了自组装层数对复合粒子性能的影响,结果如下:1)利用高温分解法,以乙酰丙酮铁Fe(acac)3为前驱体,二苄醚为高沸点有机溶剂,油胺为还原剂与修饰剂,在不同V油胺:V二苄醚条件下制备了粒径为5-7nm的Fe3O4颗粒。所得纳米颗粒溶于环己烷等有机溶剂,分散性良好;XRD测试证实了所制备的纳米粒子为具有反尖晶石结构的Fe3O4;经红外分析证实了粒子为油胺所修饰;经TEM、VSM等表征得知:粒子呈规则的球形颗粒,粒度分布均一,具有超顺磁性,其饱和磁化强度为30-40emu/g,低于文献报道,原因在于受加热设备所限的升温速率较慢。2)采用反相微乳液法,以聚氧乙烯(5)壬基苯基醚(Igepal Co-520)为表面活性剂,环己烷为连续相,氨水为分散相,通过原硅酸乙酯(TEOS)的碱性水解对制备的Fe3O4颗粒进行了SiO2壳层包覆,制备了Fe3O4@SiO2核-壳粒子(core-shell nanoparticles,CS NPs)。实验分别探究了Fe3O4用量、氨水用量、TEOS用量等单变量对核-壳粒子形貌的影响。通过TEM表征,结果表明:Fe3O4用量适中时,产物为规则的单核的核-壳结构,过少或过多时产物分别表现为含有无磁核的硅球和含有多核的核-壳结构;氨水用量会影响硅壳层的厚度,呈正相关关系;TEOS用量亦会影响硅壳层厚度,呈正相关关系,但用量过大时产物也会产生无磁核的硅球。所得核-壳纳米粒子经VSM表征,其饱和磁强度约8 emu/g,比Fe3O4颗粒有较大幅度的降低。3)利用LBL法,分别采用带相反电荷的聚电解质:聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)对核-壳粒子进行若干层的静电组装,最外层组装带正电的CdS/PAMAM量子点,制备了CS NPs/(PDDA/PSS)n/(CdS/PAMAM)磁性荧光复合纳米粒子。通过Zeta电位及水力学直径测试,验证了静电层层自组装过程的成功,同时在TEM表征中也可明确看到组装过程及组装体系的形貌。经组装后的复合纳米粒子的饱和磁强度随组装层数的增加而略有减小,而荧光发射峰的位置与CdS/PAMAM量子点一致,不受磁核影响,荧光发射强度随组装层数的增加而逐渐增加。

关键词：双功能纳米颗粒超顺磁性高温分解法反相微乳液法量子点层层自组装

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一种抑癌肽的广谱抗肿瘤效应研究

一种抑癌肽的广谱抗肿瘤效应研究

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作者：张琦东北师范大学

学位级别：硕士

肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。目前肿瘤治疗是以小分子化药为主,存在着显著的毒性、耐药性等不良反应。有研究表明多肽类药物具有毒性低、靶向明确、生物利用度高等优点,为抗肿瘤药物的研发提供了新的方向。致癌因子STAT3信号的抑制... 详细信息

肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。目前肿瘤治疗是以小分子化药为主,存在着显著的毒性、耐药性等不良反应。有研究表明多肽类药物具有毒性低、靶向明确、生物利用度高等优点,为抗肿瘤药物的研发提供了新的方向。致癌因子STAT3信号的抑制蛋白是由抑癌基因PIAS3编码的,能发挥显著的抑癌作用。本实验室前期研究结果表明,多种人类肿瘤细胞表达一种缺失87-121位氨基酸的短型PIAS3剪接异构体,失去了对肿瘤的抑制功能。PIAS3两种异构体的差异序列PIAS3-deta段是PIAS3发挥STAT3/AR信号抑制的关键结构域。这些结果暗示此差异肽段PIAS3-deta作为抗肿瘤药物研发新途径的可能性。本论文中,我们利用合成肽技术合成了PIAS3第87-121位(PIAS3-deta)共35个氨基酸的多肽(命名为PIAS3-deta肽),通过细胞学实验研究PIAS3-deta肽对肿瘤细胞的抑制特点,筛选出对其敏感的多种肿瘤细胞;证明其抗肿瘤的广谱性,揭示其最小功能域。本研究通过三种动物模型证明了PIAS3-deta肽对体内多种肿瘤的抑制效应并找到合适的体内用药浓度;而且特别设置了顺铂化药作为对照组,突出了此肽类药物在动物模型体内无毒害、具有安全性的特点;为此肽类药物具有深度研发的科学价值和经济价值提供了理论依据。首先,我们研究PIAS3-deta肽对肿瘤细胞增殖的抑制作用。MTT法检测PIAS3-deta肽和对照肽对人类11种肿瘤细胞以及两种正常细胞的作用效果,发现不同浓度的对照肽对肿瘤细胞无杀伤作用,而PIAS3-deta肽显著地抑制了各种肿瘤细胞的生长,作用浓度为10g/L(0.228uM)时即呈现广谱的抗肿瘤效果,特别是通过与化药顺铂的比较表明,PIAS3-deta肽特异性地抑制肿瘤细胞生长,并且对两种正常细胞无抑制作用,而顺铂对肿瘤和正常细胞都有显著的抑制作用,暗示了PIAS3-deta肽类药物的安全性。进而,我们比较了PIAS3-deta(1-35aa)肽以及四种不同截短型PIAS3-deta肽对肿瘤细胞的抑制作用,以寻找PIAS3-deta抑癌作用的最小功能域。我们发现与对照肽和四种不同截短型的多肽相比PIAS3-deta(1-35aa)肽对11种肿瘤细胞的抑制作用均显著高于截短型PIAS3-deta肽,提示了全长35aa对于此肽的抑癌效应是必不可少的。STAT3信号的异常活化与肿瘤发生发展的各个环节密切相关。我们研究PIAS3-deta肽对肿瘤细胞周期的影响和STAT3信号的抑制作用。流式细胞术检测PIAS3-deta肽对人前列腺癌DU145细胞、人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞周期的影响,发现PIAS3-deta肽可以使两种肿瘤细胞阻滞在S期。我们进一步研究PIAS3-deta肽对STAT3信号通路的影响。双荧光素酶报告基因实验发现,PIAS3-deta肽能够抑制STAT3转录活化STAT3-Luc荧光素酶报告基因的转录活性。Western-Blot实验表明,PIAS3-deta肽下调P-STAT3的表达;与此同时,与对照肽相比,PIAS3-deta肽下调了STAT3信号靶基因cyclinD1、BCL-2、PCNA、c-myc、survivin的表达;说明PIAS3-deta肽抑制STAT3信号通路发挥抗肿瘤作用。在体外实验证明PIAS3-deta肽广谱抗肿瘤效应的基础上,我们通过三种动物模型探讨了PIAS3-deta肽的体内抗肿瘤效应、用药剂量和安全性。首先,利用四种鼠肿瘤细胞荷瘤模型实验,我们摸索了PIAS3-deta肽体内抗肿瘤效应的有效剂量。将鼠前列腺癌RM1细胞、鼠乳腺癌4T1细胞、鼠肺癌LLC细胞、鼠黑色素瘤B16细胞移植白鼠,每点注射1×10个细胞,8天后荷瘤,肿瘤大小0.2cm,使用1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg这三种剂量PIAS3-deta肽以及10mg/kg对照肽,分别腹腔注射白鼠,每周注射两次,共36天。结果显示,10mg/kg的PIAS3-deta肽组肿瘤明显小于对照肽组,而1mg/kg和3mg/kg的PIAS3-deta肽组的肿瘤大小与对照组无明显差别。这说明PIAS3-deta肽在体内抑制肿瘤生长的有效剂量约为10mg/kg。进而,利用三种人肿瘤细胞(胃癌SGC-7901细胞、前列腺癌DU145细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞)裸鼠荷瘤模型,我们验证了10mg/kg的PIAS3-deta肽在裸鼠体内的有效性。我们将人肿瘤移植到裸鼠身上,每点注射1×10个细胞,10天后荷瘤,肿瘤大小0.2cm,使用10mg/kg的PIAS3-deta肽以及对照肽,分别腹腔注射裸鼠,每天一次,共30天。结果显示,10mg/kg的PIAS3-deta肽注射组肿瘤明显小于对照肽组。这证明了10mg/kg的PI

关键词：肿瘤 PIAS3 STAT3信号

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STAT3/MZF1调控PKM选择性剪切的机制研究

STAT3/MZF1调控PKM选择性剪切的机制研究

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作者：孙佳昕东北师范大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。基因表达的改变体现在肿瘤发生发展的多个环节,表现为正常基因向癌基因的转变或抑癌基因的失活等。选择性剪切是基因表达调控的一种重要方式,选择性剪切可以产生不同的基因型,与细胞生理、病理过程... 详细信息

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。基因表达的改变体现在肿瘤发生发展的多个环节,表现为正常基因向癌基因的转变或抑癌基因的失活等。选择性剪切是基因表达调控的一种重要方式,选择性剪切可以产生不同的基因型,与细胞生理、病理过程关联密切,并且在肿瘤的发生发展过程中发挥至关重要的作用。基因选择性剪切的机制研究将成为揭示肿瘤生长的过程、发现肿瘤治疗靶向的核心内容之一。肿瘤细胞的代谢具有不同于正常细胞的显著特点。正常细胞的代谢表现为线粒体途径的有氧氧化为主,而肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下,也可采用糖酵解的方式来分解葡萄糖并获得能量,这就是著名的Warburg效应。其中,丙酮酸激酶M2亚型(Pyruvate Kinase Isotype M2,PKM2)是参与肿瘤Warburg效应代谢的关键酶,对肿瘤的代谢和生长调节具有重要意义。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PKM)基因通过前体mRNA的选择性剪切产生PKM1和PKM2两种不同亚型。PKM1保留9号外显子,而PKM2保留10号外显子,虽然二者在结构上只有一个外显子的差异,但在组织定位和基因功能上却有显著不同。PKM1在需要大量产能的正常组织(如脑组织及肌肉组织)中表达,PKM2多表达于合成大量核苷酸的组织如肿瘤细胞中。PKM2参与Warburg效应,是肿瘤代谢的关键酶。然而,肿瘤组织如何调节PKM基因,并促使PKM2基因表达增多的选择性剪切机制还不清楚。本论文通过生物信息学、细胞分子生物学及RNA的选择性剪切的多种方法研究,对此问题进行了探讨和揭示。新型RBP(具有RNA结合功能的蛋白质)的发现是基因的选择性剪切调节的核心问题。在本论文中,我们运用生物信息学的方法对PKM的基因结构进行分析时,发现PKM基因9号外显子上游和10号外显子上游的内含子区域分别有STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)和髓样锌指蛋白1(myeloid zinc finger 1,MZF1)两种蛋白的结合位点。STAT3信号是多种肿瘤细胞持续活化的信号通路,STAT3作为转录因子在肿瘤细胞增殖中发挥重要作用,然而STAT3能否作为新型RBP蛋白调控RNA水平的选择性剪切还完全不清楚。MZF1属于Kroppel相关型(C2H2型锌指)锌指蛋白家族的转录因子,含有13个C2H12型锌指,可能具备与靶分子DNA、RNA的序列特异性结合的能力,然而MZF1基因的研究才刚开始起步,MZF1的RNA结合功能存在与否更是不清楚。STAT3和MZF1两种转录因子能否作为新型RBP,调控PKM基因的选择性剪切,可能成为揭示肿瘤Warburg效应发生的重要问题。因此本论文利用多种组织和细胞比较了STAT3和MZF1的基因表达与PKM不同表达型之间的关联;并以乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞系作为研究对象,揭示了STAT3和MZF1对不同PKM基因型的调节效应,通过EMSA和RIP实验,证明STAT3和MZF1具有PKM基因RNA结合能力的RBP属性;并系统地揭示了以STAT3/MZF1作为RBP靶点调控PKM选择性剪切的分子机制,最后,通过乳酸代谢分析,建立了STAT3/MZF1调控PKM选择性剪切而调控细胞乳酸代谢的新路径。我们的研究,提供了一种PKM基因选择性剪切调节的新型分子机制。首先,我们研究丙酮酸激酶的PKM1亚型和PKM2亚型在各种细胞及组织中的表达情况。我们发现在脑、肌肉、心脏组织以及人正常的乳腺上皮细胞和胚肾上皮细胞特异性表达PKM1,而在两种乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231和两种前列腺癌LNCaP、DU145细胞中特异性表达PKM2。然后,我们检测STAT3/MZF1的表达与PKM1/PKM2的mRNA水平和蛋白水平的相关性。发现肿瘤细胞和增殖组织中STAT3和PKM2表达的一致性,正常的组织和细胞中MZF1和PKM1表达的一致性。进一步,我们揭示了STAT3/MZF1的表达与PKM不同亚型转换之间的关系。我们在乳腺癌细胞中过表达及敲除STAT3,分别从蛋白水平、mRNA水平检测PKM1和PKM2表达情况的变化。实验结果显示过表达STAT3能够上调PKM2的mRNA和蛋白表达,下调PKM1的mRNA和蛋白表达;而敲除STAT3会下调PKM2和上调PKM1的基因表达。在正常乳腺上皮细胞中过表达及敲除MZF1后,我们更是意外的发现,过表达MZF1会促进PKM1的mRNA和蛋白表达,下调PKM2的mRNA和蛋白表达;敲除MZF1则会抑制PKM1促进PKM2的基因表达。上述实验结果提示,STAT3/MZF1在mRNA水平上调节PKM1/PKM2亚型的转换,提示了STAT3/MZF1可能参与PKM基因RNA水平上的选择性的剪切。证明STA

关键词：肿瘤 warburg效应丙酮酸激酶 STAT3 MZF1 选择性剪切

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酸敏感离子通道ASIC1a抑制剂的高通量筛选模型研究

酸敏感离子通道ASIC1a抑制剂的高通量筛选模型研究

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作者：羿菲东北师范大学

学位级别：硕士

缺血性脑中风的机制十分复杂,目前认为酸敏感离子通道(ASICs)在其中具有重要的作用,成为研究的热点。酸敏感离子通道(ASICs)是一类由胞外酸化激活的阳离子通道,近期研究发现酸敏感通道ASIC1a介导的钙超载在脑卒中引起的神经元损伤机制... 详细信息

缺血性脑中风的机制十分复杂,目前认为酸敏感离子通道(ASICs)在其中具有重要的作用,成为研究的热点。酸敏感离子通道(ASICs)是一类由胞外酸化激活的阳离子通道,近期研究发现酸敏感通道ASIC1a介导的钙超载在脑卒中引起的神经元损伤机制中具有重要作用。那么发现特异性、高活性天然小分子ASIC1a的阻断剂将成为治疗脑卒中诱发神经元损伤的新靶点。ASIC1a少量表达在神经元胞体、轴突、树突棘膜上,大部分表达在细胞质。我们首先构建了pcDNA3.1/Zeocin-mASIC1a-myc-His质粒,检测ASIC1a在COS-7、293-T、293-A、SMMC-7221、MMT、FRT、CHO七种细胞中的分布,获得ASIC1a在各种细胞中表达的初步资料。发现FRT和CHO二种细胞是适于ASIC1a上膜并能用于高通量筛选的细胞系。据报导共表达P11和ASIC1a促使ASIC1a的上膜表达,构建P11蛋白和ASIC1a共表达载体pBudCE4.1-mP11-mASIC1a,以此构建稳定表达P11和ASIC1a的细胞系。我们利用逆转录半定量PCR、免疫荧光技术检测稳定转染后克隆ASIC1a的表达。此外,摸索适合于高通量筛选的方法,为抑制剂的筛选奠定基础。本文应用钙敏感的荧光蛋白(cameleon-2载体)、钙离子敏感荧光染料Fura-2/AM和细胞毒性(LDH释放法)检测法进行ASIC1a功能检测,目的是选出有功能性表达ASIC1a的细胞克隆,最终应用于高通量筛选,使从中草药小分子库中筛选出高效的抑制剂成为可能。我们发现细胞毒性(LDH释放法)检测法是最适于高通量最初筛选方法,但其稳定性、精确性还需进一步改善。可见,此模型为发现特异性、高活性、毒副作用小的天然小分子ASIC1a阻断剂、激活剂提供了新思路,并应用于研究脑卒中诱发神经元损伤的机理和治疗研究。

关键词：酸敏感离子通道ASIC1a 缺血性脑中风高通量筛选 ASIC1a抑制剂

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二硝基甲苯催化加氢研究

二硝基甲苯催化加氢研究

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作者：张德睦北京理工大学

学位级别：硕士

本文主要是控制搅拌转速达到临界转速以上,通过实验对釜式加氢反应器吸气能力、导流筒的作用、搅拌推液量等进行研究,改进设备内进气管、导流筒、搅拌器的位置等,使机内混合液体循环方式具有从搅拌区经釜底向循环区进行强制流动的规律,... 详细信息

本文主要是控制搅拌转速达到临界转速以上,通过实验对釜式加氢反应器吸气能力、导流筒的作用、搅拌推液量等进行研究,改进设备内进气管、导流筒、搅拌器的位置等,使机内混合液体循环方式具有从搅拌区经釜底向循环区进行强制流动的规律,以保证液体中气体的有效分散和催化剂的均匀分布。采用改进的加氢反应釜为场所,用间歇液相催化加氢工艺,以2,4-二硝基甲苯为原料,选用镍催化剂,乙醇为溶剂,保证反应釜搅拌转速使加氢反应进入本征反应区内,控制DNT浓度、反应压力、催化剂浓度、反应温度等条件的某一项,保持其他条件不变,用氢气质量流量计计量反应过程中氢气的用量,换算为物料浓度的变化,进行实验数据处理,在控制DNT浓度为8%、反应压力20bar、催化剂浓度0.3%、反应温度120℃等工艺条件下,通过反应速率曲线,拟合、推导出具有工程化特点反应釜结构下反应速率公式为r=1408e P·C。

关键词：二硝基甲苯催化加氢反应釜反应速率

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Trudinger-Moser不等式相关问题的研究

Trudinger-Moser不等式相关问题的研究

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作者：杨柳淮北师范大学

学位级别：硕士

设W1,n(Rn)为Sobolev空间.对于任意的τ>0,p>n>2并且00,0<β<1,如下Trudinger-Moser不等式能够被非负递减径向对称的函数uβ∈W1,n(Rn)∩C0(Rn)∩C1(Rn\{0})达到,且满足∫Rn(|▽u|n+τ|u|n)dx=1,这里Ψ(n,t)=et-∑j=0n-2tj/j!.本文考虑... 详细信息

关键词： Trudinger-Moser不等式极值函数爆破分析

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前列腺癌激素非依赖性转变和细胞凋亡过程中PIASy与hZimp10启动子甲基化修饰变化的对比研究

前列腺癌激素非依赖性转变和细胞凋亡过程中PIASy与hZimp10启动子...

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作者：王中南东北师范大学

学位级别：硕士

DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组最常见的一种DNA共价修饰形式,是表观遗传学的一个重要方面。这一修饰现象广泛存在于多种生物体中,且与肿瘤的进展密切相关。肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变,表现为抑癌基因的高甲基化... 详细信息

DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组最常见的一种DNA共价修饰形式,是表观遗传学的一个重要方面。这一修饰现象广泛存在于多种生物体中,且与肿瘤的进展密切相关。肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变,表现为抑癌基因的高甲基化与癌基因的去甲基化。作为全世界范围内的男性恶性肿瘤——前列腺癌的进展过程中同样伴随着某些抑癌基因的高甲基化,如STP1、ER等。转录调控因子的启动子甲基化的深入研究对于揭示恶性肿瘤的发病机制具有重要意义。PIASy和hZimp10是两种新型的转录调控因子,并在包括前列腺组织和睾丸组织中特异性表达,对一些抑癌基因如P53、Smad的转录活性具有重要的调节作用。但是,PIASy和hZimp10对前列腺癌细胞的影响及其作用机制的研究还未见相关报道。本文从PIASy和hZimp10的启动子甲基化的角度出发,对其在前列腺癌激素非依赖性转变和细胞凋亡过程的作用进行了初步的揭示和探讨。首先,我们检测了不同进展度的前列腺癌细胞内PIASy和hZimp10蛋白的表达水平,发现在前列腺癌细胞由激素依赖型向激素非依赖型的恶性转变过程中,PIASy和hZimp10蛋白的表达水平下降,在激素非依赖型PC3和DU145细胞中的表达显著减少,提示了PIASy和hZimp10与肿瘤进展相关。然后,通过序列分析显示,PIASy与hZimp10启动子上CpG含量均异常丰富,推测PIASy与hZimp10的启动子序列上很可能存在甲基化修饰。我们通过5-氮孢苷诱导实验检测了两者启动子的甲基化修饰情况。发现5-氮孢苷诱导显著提高DU145细胞中PIASy的蛋白表达水平,而hZimp10蛋白表达水平没有改变。进一步,通过MSP实验我们检测了三种前列腺癌细胞内PIASy与hZimp10启动子甲基化修饰水平。激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP的PIASy启动子甲基化修饰程度很低,而激素非依赖型前列腺癌细胞PC3和DU145中,PIASy启动子出现了显著的甲基化修饰,证明了激素非依赖型的恶性转变过程中PIASy表达水平的下降确实由于其启动子的甲基化修饰所致。与此不同的是,在不同的前列腺癌细胞中均未检测到hZimp10启动子的甲基化修饰。说明尽管在前列腺癌细胞激素非依赖型转变过程中,hZimp10与PIASy表达水平都下降,但是其分子调节机制不同。锌可以促进前列腺癌细胞凋亡,我们进一步分析了PIASy启动子在细胞凋亡过程可能的甲基化修饰变化。发现在Zn2+诱导前列腺癌细胞凋亡过程中,PIASy和hZimp10的蛋白表达明显上调,但是MSP检测表明,PIASy启动子甲基化修饰无显著变化,不同于5-氮孢苷的作用效果。说明Zn2+促进PIASy和hZimp10表达上调并非通过DNA甲基化修饰途径引起,其分子机制需要更深入的研究。

关键词： PIASy hZimp10 前列腺癌 ZnSO4 甲基化修饰

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抗膀胱癌天然化合物木香烯内酯和高氯酸盐血竭素的确定和作用机制研究

抗膀胱癌天然化合物木香烯内酯和高氯酸盐血竭素的确定和作用机制...

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作者： MAHADEV（代夫）东北师范大学

学位级别：硕士

肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病,尚无有效治疗方法。很多临床药物经常产生耐药性和毒副作用,因此从中药天然产物中寻找新型抗肿瘤药物展示了良好的应用前景。本文以膀胱癌为靶点,系统研究了几种天然化合物的抗肿瘤效应,重点揭示了木... 详细信息

肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病,尚无有效治疗方法。很多临床药物经常产生耐药性和毒副作用,因此从中药天然产物中寻找新型抗肿瘤药物展示了良好的应用前景。本文以膀胱癌为靶点,系统研究了几种天然化合物的抗肿瘤效应,重点揭示了木香烯内酯和血竭素高氯酸盐促进膀胱癌凋亡的分子机制。在本论文中,我们首先研究了包括倍半萜内酯类(木香烯内酯,异土木香内酯和altholactone),生物碱类(吴茱萸碱)以及三萜式皂甙(土贝母皂甙-1),血竭素高氯酸盐六种天然化合物,对人膀胱癌T24细胞系的细胞活性及细胞凋亡的影响。通过MTT实验,检测六种天然化合物成分(木香烯内酯,异土木香内酯,altholactone,吴茱萸碱,血竭素高氯酸盐和土贝母皂甙-1)对T24细胞的抗增殖作用,发现六种天然化合物对T24细胞的增殖具有抑制作用,且呈现剂量性依赖。其中,吴茱萸碱(IC5。15 μM)对T24细胞的生长抑制效应最强,之后依次是土贝母皂甙-1(IC5022.5 μM),异土木香内酯(IC50 28.8 μM),altholactone(IC50 43.5μM)和木香烯内酯(IC50 46.5μM)血竭素高氯酸盐(IC5。80.7μM)。我们从六种天然化合物中筛选出木香烯内酯,血竭素高氯酸盐,对其抑制膀胱癌T24细胞系的细胞增殖的分子机制进行深入研究。通过细胞生存能力实验(钙黄绿素-AM(Calcein-AM),碘化丙啶(PI)染色),确定了木香烃内酯,血竭素高氯酸盐对T24细胞的增殖抑制效应。运用流式细胞术,证明木香烯内酯,血竭素高氯酸盐促进T24细胞凋亡,且呈剂量性依赖性。活性氧ROS重要的胞内信号级联的传递分子。体内过多的ROS能够引起细胞的氧化应激反应,诱导细胞功能丧失以及凋亡过程。利用荧光染料2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)检测经药物处理的T24细胞内ROS的变化,结果表明,木香烯内酯,血竭素高氯酸盐诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡与活性氧ROS上调以及线粒体膜电位改变有关,其作用可被ROS特异性抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)所阻断。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2两者之间的相对比例参与调节细胞内线粒体凋亡途径的调节,表现为调节从线粒体膜通透性增加和细胞色素C释放后的Caspases级联反应激活和细胞凋亡的全过程。蛋白免疫印迹检测表明,木香烃内酯,血竭素高氯酸盐导致人膀胱癌T24细胞系Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白和survivin蛋白表达下降,并显著促进了 caspase-3蛋白及其下游靶蛋白PARP的剪切活化。所以,本论文阐述了六种天然化合物对膀胱癌细胞增殖具有抑制作用,重点揭示了木香烃内酯,血竭素高氯酸盐抑制膀胱癌细胞增殖的深层分子机制,为这些天然化合物在膀胱癌治疗的潜在应用提供了的理论基础。

关键词：膀胱癌木香烯内酯高氯酸盐血竭素细胞凋亡

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