检索结果-南通市图书馆

作者：刘晓燕南昌大学

学位级别：硕士

从5个天然居群(江西三清山、安徽休宁、浙江临安、湖南阳明山自然保护区、阳明山老屋场)采集华东黄杉样本,以改良的CTAB法从华东黄杉叶片中制备模板DNA,优化了PCR循环参数,建立了ISSR-PCR扩增的最佳反应体系,筛选出扩增多态性片断较多... 详细信息

从5个天然居群(江西三清山、安徽休宁、浙江临安、湖南阳明山自然保护区、阳明山老屋场)采集华东黄杉样本,以改良的CTAB法从华东黄杉叶片中制备模板DNA,优化了PCR循环参数,建立了ISSR-PCR扩增的最佳反应体系,筛选出扩增多态性片断较多且扩增产物稳定的引物,通过10条ISSR引物对89个华东黄杉个体的基因组DNA进行扩增,对华东黄杉居群的遗传多样性和遗传结构进行了研究。研究结果表明:CTAB提取液中的体积和提取时间对模板DNA有一定的影响。ISSR扩增条件为:20μLPCR反应体系中,2μL１0χTaq酶配套缓冲液,1.5U Taq聚合酶,1.5～2.5mmol/L MgCl,0.2μmol/L引物,0.2mmol/L dNTPs,10ng/L模板DNA。最佳扩增反应程序:94℃变性5min,1个循环;94℃变性30s,52℃(46-56℃不定)退火45s,72℃延伸2min,40个循环;最后在72℃延伸5min,1个循环。共对100条ISSR引物进行了筛选,分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的10条ISSR引物用于5个居群DNA样本扩增,共扩增出76条带,其中多态性条带数为69个,多态性位点百分比为90.79%,以三清山居群的多态性位点百分比89.47%,安徽休宁居群的多态性百分比最低为56.58%。根据不同个体的扩增图构建了0、1矩阵(其中模糊带和弱带忽略不计)输入计算机。对ISSR数据处理结果如下:POPGENE分析结果表明,华东黄杉具有丰富的遗传多样性,Nei’s基因多样性H=0.3361,Shannon’s多态性指数I=0.4974。AMOVA分析表明,在总的遗传变异中有26.88%的变异发生在居群间,73.12%的变异发生在居群内。由UPGMA聚类分析得知,5个居群中,湖南阳明山两支与浙江先聚为一支,再与安徽休宁聚为一支,最后与江西三清山聚合。鉴于华东黄杉生境环境的特殊性和人为大量的砍伐,华东黄杉的数量逐渐减少,建议在华东黄杉分布区建立自然保护区,以江西三清山为核心地区,对其生存空间进行长期、有效的保护。另外,在居群间进行植株和幼苗的相互移栽,以提高居群间的基因交流,最大限度保护华东黄杉的遗传多样性。

关键词：华东黄杉 ISSR技术遗传多样性

环介导等温扩增技术检测嗜水气单胞菌方法的建立

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环介导等温扩增技术检测嗜水气单胞菌方法的建立

作者：匡燕云南昌大学

学位级别：硕士

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出10～9靶序列拷贝，扩增产物是一系列... 详细信息

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出10～9靶序列拷贝，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。本研究针对已报道的嗜水气单胞菌(aeromonas ***，Ah)保守的气溶素基因(aerolysin，Aer)设计了3对特异性的引物，利用环介导等温扩增(LAMP)技术来扩增Ah基因组DNA，扩增出一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，成功建立了LAMP检测Ah的新方法。该方法特异性好、敏感性高而且节省时间。本实验分别设计了LAMP和PCR的温度梯度和浓度梯度实验，从而获知LAMP检测Ah的最适温度是64℃，LAMP对抽提的Ah DNA最低检出浓度为38fg/tube，PCR对Ah DNA最低检出浓度38pg／tube。LAMP对Ah的活菌浓度最低检出量为32 cell／tube，而PCR却检测不到。LAMP技术的灵敏度是PCR的1000倍，并且比PCR方便快捷。本实验还通过设计一对环引物对整个体系进行优化，使检测时间缩短至半个小时，同时提高了反应的灵敏度。

关键词：等温扩增核酸链置换反应内引物外引物嗜水气单胞菌

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鄱阳湖北湖细菌多样性研究

鄱阳湖北湖细菌多样性研究

作者：龚世杰南昌大学

学位级别：硕士

鄱阳湖位于长江中下游,江西省北部,是我国第一大淡水湖,它是一过水性、吞吐型湖泊。该湖北湖主湖区——老爷庙水域位于鄱阳湖盆地北部,为鄱阳湖入长江的咽喉要处,是江西省内河水运通往长江、长江水运进入江西的必经之道。该水域生态环... 详细信息

鄱阳湖位于长江中下游,江西省北部,是我国第一大淡水湖,它是一过水性、吞吐型湖泊。该湖北湖主湖区——老爷庙水域位于鄱阳湖盆地北部,为鄱阳湖入长江的咽喉要处,是江西省内河水运通往长江、长江水运进入江西的必经之道。该水域生态环境复杂,是研究鄱阳湖微生物多样性的理想场所。本论文首次通过16S rDNA-RFLP(16S rDNA restriction fragment lengthpolymorphism)的分子生物学方法直接从鄱阳湖老爷庙水域的贫水期水样和丰水期水样中提取总DNA,通过PCR扩增两个水样的16S rDNA,构建了16S rDNA文库,并且利用HaeⅢ和HinfⅠ限制性内切酶对阳性克隆进行了RFLP分析。酶切结果进一步通过Biotools软件(Biological ToolBox version 0.10)和AnalyticRarefaction(version 1.3)分析,而后对每个分类单元的克隆子都进行了测序分析,将序列提交到国际分子生物学数据库(GenBank)进行Blast相似性比较,用MEGA(version 4.0)软件构建系统发育树进行系统发育分析,结果表明: 1.从鄱阳湖老爷庙水域贫水期环境水样PYS-1的16S rDNA文库中随即挑选了96个克隆,通过菌落PCR技术筛选出了92个阳性克隆,其中共55个OTUs。在测序得到的这55个克隆的16S rDNA序列中,2条为嵌合序列。经过系统学分析,53条非嵌合序列分属于以下六大细菌类群:Alpha-proteobacteria(1.1%)、Beta-proteobacteria(63%)、Gamma-proteobacteria(9.8%)、Epsilon-proteobacteria(1.1%)、Actinobacteria(5.4%)、Bacteroidetes(6.5%)。另外,还有8条序列(10.9%)未确定所属类群(Unclassified)。 2.从鄱阳湖老爷庙水域丰水期环境水样PYS-2的16S rDNA文库中随即挑选了96个克隆,通过菌落PCR技术筛选出了88个阳性克隆,共得到了44个OTUs,在测序得到的这44个克隆的16S rDNA序列中,无嵌合序列。经过系统学分析,44条非嵌合序列分属于以下八大细菌类群中:Alpha-proteobacteria(4.5%)、Beta-proteobacteria(11.4%)、Bacteroidetes(25%)、Gamma-proteobacteria(28.4%)、Actinobacteria(14.8%)、Chlorobi(4.5%)、Planctomycetes(2.3%)、Verrucomicrobia(1.4%)。另外,还有7条序列(7.95%)未确定所属类群(Unclassified)。 3.综合比较分析鄱阳湖老爷庙水域环境水样和其它淡水湖泊的细菌多样性,发现Proteobacteria类群的细菌在淡水湖泊中广为存在,并且以β-Proteobacteria为主要类群。表明β-Proteobacteria是不同环境淡水湖泊的广适类群。 4综合比较分析了PYS-1和PYS-2两个16S rDNA文库的Blast相似性比较结果,发现老爷庙水域的丰水期水样的细菌群落多样性明显比贫水期水样更为丰富。 ***结果和系统发育学分析表明:鄱阳湖水环境细菌群落受到了人类活动的影响。总之,基于16S rDNA序列的非培养技术结合统计学分析研究,结果表明鄱阳湖水环境中具有丰富的细菌资源,值得进一步深入研究,为进一步认识鄱阳湖微生物群落结构和功能提供客观的依据。

关键词：鄱阳湖老爷庙水域细菌多样性 RFLP 16S rDNA

小鼠ICSI新技术及其用于提高人类辅助生殖技术的研究

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小鼠ICSI新技术及其用于提高人类辅助生殖技术的研究

作者：曾明南昌大学

学位级别：硕士

胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)是20世纪80年代发展的一种新型辅助生殖技术,其实质就是用注射针携带单个精子直接注入到卵子胞浆内从而带到受精的目的。ICSI的建立为许多不孕不育夫妇带来了福音,目前已成为... 详细信息

胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)是20世纪80年代发展的一种新型辅助生殖技术,其实质就是用注射针携带单个精子直接注入到卵子胞浆内从而带到受精的目的。ICSI的建立为许多不孕不育夫妇带来了福音,目前已成为治疗男性不育的一种常规治疗手段。然而由于缺少合适的动物模型,阻碍了人类ICSI研究。小鼠卵子是一个非常理想化的ICSI动物模型,但因小鼠卵子体积较小、抗损伤能力弱等原因,小鼠ICSI研究进展缓慢。直到1995年Kimura等人将Piezo仪器用于小鼠卵ICSI,才获得了较高的鼠卵成活率、受精率及囊胚率。然而,由于Piezo-ICSI效果不稳定且存在潜在的汞污染而限制了其在临床及科研上的应用。本文是对一项新研发的ICSI技术(New-ICSI, N-ICSI)的应用和改进。N-ICSI的方法为：将固定针做成喇叭状的开口,先用固定针吸入部分透明带及胞质,然后直接用常规的尖口注射针插入卵胞质中,进行抽吸破膜并注射精子。现对实验结果归纳如下：①比较卵子行N-ICSI和C-ICSI的体外发育情况。实验表明,与常规的鼠卵注射方法(C-ICSI)相比,N-ICSI可以极其显著提高鼠卵ICSI后成活率(22% vs89%,P0.05)。N-ICSI和C-ICSI的囊胚率差异也不显著(65% vs 62%,P>0.05),但都显著低于激活组(97%,P<0.05)。优化和改善N-ICSI的实验条件,也许可以提高成囊率。②比较固定针开口内径及固定针吸入胞质长度这两个主要参数的不同组合对囊胚率的影响。结果发现当固定针为45μm的时候,卵子的成活率较低(64%)显著低于固定为50μm或55μm的卵成活率。而当吸入胞质长度为75μm时,成囊率(0%和33%)显著低于大部分其他组合,或者正常受精率极低(只有36%,其余为三倍体或多倍体)。而当固定针内径为55μm,胞质吸入长度为40μm时,卵子成活率、正常受精率、囊胚率。与内径为45μm吸长40μm相当,但内径为55μm的卵裂率明显低于内径为50μm的卵裂率。而当固定针内径为50μm,胞质吸入长度为40μm,可得到可观的成活率,正常受精率,卵裂率,桑椹胚率和囊胚率,故将该组参数视为最佳N-ICSI条件。③建立大批量小鼠卵子冷冻技术,每个载体可以装载20-50个卵子。将人精子注射(N-ICSI)到这些解冻复苏的小鼠卵子中并结合临床ICSI资料,可以判定部分临床ICSI过程失败的原因。④将N-ICSI最佳条件用于人精子注射鼠卵的跨物种ICSI,比较不同的人精子制动时间对鼠卵激活能力的影响。实验表明：用人精子对鼠卵行N-ICSI,可得到80%以上的成活率、90%以上的受精率和70%的卵裂率;并发现人精子在制动30min内激活鼠卵的能力没有发生变化。以上结果表明,本研究建立了一种高效、便捷、对鼠卵损伤较小的ICSI新方法。用人精对鼠卵行N-ICSI取得了很好的效果。然而,固定针吸入部分胞质的变形是否会对胚胎的后期发育有影响仍值得进一步研究。尽管如此,由于该方法的简单实用性,值得我们在临床及科研上尝试使用。

关键词：胞质内单精子注射(ICSI) 喇叭形固定针鼠卵成活率囊胚率跨物种间ICSI

南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆和分析

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南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆和分析

作者：冯唐锴南昌大学

学位级别：硕士

β-胡萝卜素羟化酶是植物类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶，它催化了植物中β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素合成玉米黄素的过程。β-胡萝卜素羟化酶广泛存在于植物、蓝藻和细菌等生物中，其基因在高等植物中多成对出现，在原核生物中... 详细信息

β-胡萝卜素羟化酶是植物类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶，它催化了植物中β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素合成玉米黄素的过程。β-胡萝卜素羟化酶广泛存在于植物、蓝藻和细菌等生物中，其基因在高等植物中多成对出现，在原核生物中则处于基因簇内。该酶是一种无血红素双铁单加氧酶，分子中有富含保守组氨酸的模体。多种生物的β-胡萝卜素羟化酶基因已被克隆并分别在细菌、蓝藻或植物中表达。玉米黄素能帮助植物抵御胁迫环境，β-隐黄素对癌症等人类疾病有抑制作用。采用基因工程手段改造β-胡萝卜素羟化酶基因，将为培养高抗逆性作物和大规模生产β-隐黄素这种抗癌物质提供新途径。本论文根据已报道的多种柑橘β-胡萝卜素羟化酶基因保守序列，设计4对引物。用它们扩增南丰蜜橘(Citrus reticulata Blanco ***(Tanaka)***)基因组DNA，得到四条长度为470bp，761bp，294bp，991bp的片段。将这些片段克隆到pMD18-T载体，并进行测序。测序结果拼接成一条长2326bp的全长序列。分析发现该基因含六个内含子，七个外显子。内含子长度与拟南芥相比有较大变化，外显子编码了含311个氨基酸的蛋白质。不同柑橘β-胡萝卜素羟化酶蛋白间十分保守。该蛋白具有多种磷酸化位点，五个跨膜螺旋区及由十个保守的组氨酸构成的四个组氨酸模体。

关键词： β-胡萝卜素羟化酶 β-隐黄素类胡萝卜素

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彭泽鲫鱼新型抗菌肽基因的筛选和研究

彭泽鲫鱼新型抗菌肽基因的筛选和研究

作者：陈福南昌大学

学位级别：硕士

抗菌肽是特定基因编码产生的一类小分子多肽,结构和组成复杂多样,是生物天然免疫的重要组成部分。抗菌肽因具有独特的抗菌机制、广谱的杀菌作用、高效的抗菌活性以及靶菌株难以产生抗性等优点而倍受关注。近年来抗菌肽的开发与应用已经... 详细信息

抗菌肽是特定基因编码产生的一类小分子多肽,结构和组成复杂多样,是生物天然免疫的重要组成部分。抗菌肽因具有独特的抗菌机制、广谱的杀菌作用、高效的抗菌活性以及靶菌株难以产生抗性等优点而倍受关注。近年来抗菌肽的开发与应用已经成为研究的热点。目前,在多个物种(如昆虫、哺乳动物、两栖动物等)中都发现了大量抗菌肽,而淡水鱼类中发现的抗菌肽并不是很多。本实验的目的是分离和研究新的鱼类抗菌肽基因,并对抗菌肽结构、功能和作用机理进行分析,为后续的新型抗菌肽的设计和表达奠定基础。为得到抗菌肽基因序列,我们先用嗜水气单胞菌诱导彭泽鲫鱼产生免疫反应,并提取鱼肝脏的RNA,接着通过DDRT-PCR找到差异条带,选择150bp左右的差异条带进行扩增并测序,然后根据测序结果设计引物用RACE的方法找到差异片段所在基因的全长。我们用2条锚定引物和8条随机引物组合进行DDRT-PCR,找到多条差异条带,选取了最有可能的条带进行测序,最后得到了4条序列(CF-1、CF-2、CF-3、CF-4)。序列比对分析表明,CF-1和CF-2在进化中较保守,广泛存在于不同的生物中。CF-4在Otolemur garnetti中有同源序列。这三条序列的功能目前尚未报道,它们可能是彭泽鲫鱼中存在的新的抗菌肽基因序列。

关键词：彭泽鲫鱼嗜水气单胞菌抗菌肽基因筛选

胰腺癌循环肿瘤细胞（CTCs）的转录组分析

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胰腺癌循环肿瘤细胞（CTCs）的转录组分析

作者：郭宝森南昌大学

学位级别：硕士

胰腺癌是预后较差和死亡率较高的恶性肿瘤之一,其中肿瘤细胞的转移是造成胰腺癌患者死亡的主要原因。胰腺癌中某些细胞能够突破基底膜、渗透至血液中,并伴随循环系统迁移至其他组织或器官,这些细胞被称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor... 详细信息

胰腺癌是预后较差和死亡率较高的恶性肿瘤之一,其中肿瘤细胞的转移是造成胰腺癌患者死亡的主要原因。胰腺癌中某些细胞能够突破基底膜、渗透至血液中,并伴随循环系统迁移至其他组织或器官,这些细胞被称为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)。近年来的研究发现,CTCs在患者液体活检中具有重要的预后意义。不仅如此,越来越多的证据表明,CTCs作为肿瘤转移的种子,在脱离原发病灶后能够抑制失巢凋亡,在血液循环中抵抗流体剪切力和并躲避免疫监视,其存活现象与内在基因表达机制可能能够为肿瘤治疗和转移阻断提供新的思路。然而,目前关于CTCs的内在机制的研究仍不充分,其中的关键调控因子、不同转录模式、存活和免疫逃逸机制以及关键基因与患者生存的确切关系仍未得到深入的、系统的研究。为了研究胰腺癌CTCs中的关键基因和表达模式,我们首先下载了来自GEO数据库的包含75个胰腺癌CTCs的共187个样本的转录组数据,识别其中未被注释的CTCs特异性的新lncRNA,并通过其表达调控作用及共表达网络的计算,寻找其中起到关键调控作用的lncRNA。基于包含新lncRNA的胰腺癌转录组数据,我们对胰腺癌CTCs的不同类型的表达模式进行识别,并尝试还原不同CTCs类型之间的关系。同时,我们通过2组胰腺癌CTCs转录组数据和3组其他肿瘤CTCs数据,验证所构建的共表达模块的保守性,寻找在不同胰腺癌CTCs中普遍存在的基因表达模式,并获得了3个在肿瘤中普遍存在的表达模块。此后我们进一步引入TCGA、ICGC数据库中的胰腺癌患者表达谱与临床数据,通过生存分析获取CTCs中的重要的的生存相关基因,并构建了一组由胰腺癌CTCs基因构成的具有良好预后效果的生存模型,以进一步从患者生存预后的角度阐释CTCs关键基因的重要性。通过上述分析,我们在胰腺癌CTCs中获得了2026个高置信度的新lncRNA,识别出5种不同的CTCs分组、重现了他们之间的关系、识别出不同类型的CTCs中的Wnt通路等关键信号通路及lncRNA如XLOC54311、XLOC07054、XLOC82573等在共表达调控网络中的枢纽作用。在胰腺癌结果的验证分析中,我们在多组胰腺癌和其他肿瘤CTCs数据中获得了3个保守的共表达模块。通过肿瘤数据与临床信息的结合,我们计算出胰腺癌CTCs中具有预后意义的76个生存相关基因和由ANKRA2,GBP2,KRT19,DOCK9,TRIM46这五个在胰腺癌CTCs中具有保守的表达模式的基因构成的预后模型,并从新鉴定的lncRNA中发现了可能能够有效调控KRT19表达的XLOC11657。这些研究无疑会在靶向治疗、肿瘤转移阻断和CTCs的内在机制研究中起到重要作用。

关键词：胰腺癌 CTCs lncRNA 共表达模式预后

中国特有濒危植物穗花杉的遗传多样性分析及其保育

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中国特有濒危植物穗花杉的遗传多样性分析及其保育

作者：朱柏芳南昌大学

学位级别：硕士

从7个天然居群(井冈山西平、井冈山和遂川交界处、铜鼓龙门、宜丰官山大西坑、小西坑、宜春明月山和军峰山)和一个栽培居群(庐山居群)采集穗花杉样本,以改良CTAB法从穗花杉叶片中制备模板DNA,优化了PCR循环参数,建立了RAPD-PCR和ISSR-PC... 详细信息

从7个天然居群(井冈山西平、井冈山和遂川交界处、铜鼓龙门、宜丰官山大西坑、小西坑、宜春明月山和军峰山)和一个栽培居群(庐山居群)采集穗花杉样本,以改良CTAB法从穗花杉叶片中制备模板DNA,优化了PCR循环参数,建立了RAPD-PCR和ISSR-PCR扩增的最佳反应体系,筛选出能扩增多态性片段较多且扩增稳定的引物,通过用12条RAPD引物和10条ISSR引物分别对74个和66个穗花杉个体的基因组DNA进行扩增,对穗花杉居群的遗传多样性和遗传结构进行了研究。实验结果表明CTAB提取液中丙酮去色素处理可以提高产物的纯度,但产率较低;另外CTAB提取液的抽提时间对产率影响较小。RAPD-PCR扩增条件经过优化后确定为20μl PCR反应体系中,10×Buffer缓冲液2μl,模板70ng,Mg2.0mmol/L,dNTPs 0.2mmol/L,引物0.60μmol/L,Taq酶1.5U;RAPD最佳扩增程序为94℃5min,1个循环;94℃ 1min、37℃ 1min、72℃ 2min,40个循环;72℃ 10min,1个循环。ISSR扩增条件经过优化后确定为:20μl PCR反应体系中,2μl10×Taq酶配套缓冲液,1.8 U Taq聚合酶(上海生工公司),0.2 μmol/l引物,0.18 mmol/l dNTPs,1.5～2.5 mmol/l MgCl,10 ng/μl模板DNA;ISSR-PCR扩增反应程序:94℃ 5min,1个循环;94℃ 30S,50℃(46-54℃不定)45S,72℃ 1.5min,35个循环;72℃ 7min,1个循环:4℃ 30min。本研究共对120条RAPD引物和100条ISSR引物进行了筛选,分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的12条RAPD引物和10条ISSR引物用于8个居群DNA样本扩增。结果为:RAPD标记技术共产生了90条带,其中多态性带为78条,多态性位点百分率(PPL)为86.67%;ISSR引物标记技术共产生了61条带,其中多态性带为51条,多态性百分率(PPL)83.61%。根据不同个体的扩增图谱构建了0、1矩阵(其中模糊带和弱带不计)输入计算机。对RAPD数据处理结果如下:POPGENE分析结果表明,穗花杉具有丰富的遗传多样性,官山大西坑(DK)居群遗传多样性水平最高(PPL=74.44%,h=0.3178,I=0.4567),庐山(LS)居群的遗传多样性水平最低(PPL=10%,h=0.0414,I=0.0605)。Nei’s遗传多样性分析和AMOVA分析表明,

关键词：穗花杉 RAPD技术 ISSR技术遗传多样性遗传结构保护策略保育

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LncRNA介导人基因组DNA甲基化研究

LncRNA介导人基因组DNA甲基化研究

作者：邹发林南昌大学

学位级别：硕士

DNA甲基化作为一种在表观遗传学上非常关键的标记,在生物体中很多过程中发挥重要的功能。比如基因表达调控,细胞分化,疾病产生,胚胎发育等过程中DNA甲基化都发挥着举足轻重的作用。目前,已经报道的参与DNA甲基化过程的酶有:DNA甲基转移... 详细信息

DNA甲基化作为一种在表观遗传学上非常关键的标记,在生物体中很多过程中发挥重要的功能。比如基因表达调控,细胞分化,疾病产生,胚胎发育等过程中DNA甲基化都发挥着举足轻重的作用。目前,已经报道的参与DNA甲基化过程的酶有:DNA甲基转移酶Ⅰ(Dnmt1),DNA甲基转移酶ⅢA(Dnmt3a),DNA甲基转移酶ⅢB(Dnmt3b)。过去几年,在研究植物中的DNA甲基化机制时发现,从头合成甲基化中有siRNA和lncRNA的参与[1]。去年,中国学者在小鼠的骨骼肌成肌细胞中发现有LncRNA Dum调控其靶基因Dppa2的DNA甲基化从而抑制该基因的表达,达到基因沉默的效果[2]。这证明在小鼠中lncRNA能够通过介导Dnmts定位到基因的特定位点,导致该位点的DNA甲基化,从而调控基因表达,进而影响细胞功能。因此,探讨在人细胞中lncRNA与Dnmts结合并且在基因甲基化过程的作用是否存在普遍现象具有重要意义,为解释基因组DNA甲基化机制提供支持。本文利用经典的RNA免疫共沉淀(RNA immune coprecipitation)技术来捕获由ES向NPC分化过程中能够和DNA甲基转移酶相互作用的RNA[3]。并且通过特定的方法去除基因组DNA的干扰之后,鉴别所捕获的RNA中是否有lncRNA,以此来证明在人细胞分化过程中lncRNA能够参与DNA甲基化过程。用RIP捕获能够和Dnmt3b结合的RNA,通过生物信息学方法分析RNA的类型,用RIPSeeker分析Dnmt3b在基因组上可能的结合位点。并且利用RIP测序数据,采用tophat及cufflink软件联合使用的方法对RIP数据进行组装,并结合预测软件(CPC、CPAT)评价这些得到的转录物是否存在开放阅读框和开放阅读框的长度及保守性,相邻核苷酸三聚体在编码与非编码区分布的差异程度等一系列指标预测其编码能力强弱,从而判断一个转录物是不是属于非编码基因。结果小结如下:1、在H9-ES细胞系,ES向NPC分化第二天的细胞和来自于ES的成熟NPC细胞中,我们共获得了14957个新的lncRNA分子,其中有44个lncRNA分子与mRNA反向配对;2、在H9-ES细胞向NPC细胞分化过程中Dnmt3b和Dnmt3a的表达量处于动态变化过程中,两者同时在分化第二天的时候表达量达到最高,并且Dnmt3b的表达量比Dnmt3a的表达量更高;3、通过利用Dnmt3b和IgG抗体的RIP技术和RIPseeker分析软件,我们发现在在ES细胞中lnc RNA能够和Dnmt3b结合,在lncRNA和基因组结合位点附近的基因有13个mRNA,lncRNA和microRNA及Y RNA各1个。这些RNA结合位点临近基因的甲基化水平都是比较低的,这些基因的主要功能是和细胞跨膜运输和增殖相关;4、在H9-ES细胞向NPC细胞分化过程中lncRNA能够和Dnmt3b结合,其结合位点临近基因有25个mRNA,7个snoRNA,2个microRNA,lncRNA1个。并且发现这些RNA结合位点临近基因的甲基化情况都比较高,在这些结合位点呈现出很高的CpG甲基化现象,并且这些基因的主要功能都是和细胞分化及神经分化相关;5、NPC细胞中也发现有和Dnmt3b结合的RNA,其结合位点临近基因有132个mRNA,16个snoRNA,5个microRNA和2个lncRNA。通过UCSC,我们发现这些能够和Dnmt3b结合的RNA临近基因的DNA甲基化水平都比未分化的ES细胞中高,并且在这些结合位点的CpG甲基化也很高。并且其结合位点附近基因的功能都是和RNA的生物合成和降解相关。

关键词： DNA 甲基化长链非编码RNA RNA免疫共沉淀 DNA甲基转移酶 RIPSeeker

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家蚕microRNA的计算机鉴定及分析

家蚕microRNA的计算机鉴定及分析

作者：姚绛南昌大学

学位级别：硕士

microRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的内源非编码小分子RNA,在线虫、果蝇、家鼠、人及拟难芥等生物中普遍存在。研究表明,这些miRNA作为一种真核生物体内的重要的调节因子,在生物体内发挥着重要的调节作用,并影响着生物体生命活动的各个... 详细信息

microRNAs(miRNAs)是一类长约22nt的内源非编码小分子RNA,在线虫、果蝇、家鼠、人及拟难芥等生物中普遍存在。研究表明,这些miRNA作为一种真核生物体内的重要的调节因子,在生物体内发挥着重要的调节作用,并影响着生物体生命活动的各个方面。虽然目前通过实验和计算机的方法在植物和动物中发现了众多miRNA分子,但是在各个物种中所鉴定的miRNA的数量远不及理论上的饱和值,所以对miRNA的分离鉴定依然是miRNA研究的一个热点。近年来,随着人类基因组和许多模式生物基因组测序工作的完成,利用计算机搜索miRNA的方法逐渐普及。动物miRNA基因在进化上具有高度的保守性,许多序列都可以在亲缘关系相近的物种中找到,甚至在亲缘关系较远的物种中都有发现。因而,我们可以利用已鉴定的种子序列,通过生物信息学同源性搜索的方法来搜寻家蚕的miRNA基因及其作用靶标。这有助于我们进一步了解miRNA对家蚕生长发育的影响与作用,有利于通过基因工程手段改良家蚕的品种与质量,选育更高产的家蚕品种,从而增加经济效益。本文采用计算机RNA组学和实验RNA组学相结合的方法,利用成熟miRNA的序列保守性以及前体结构具有发夹二级结构的特性在家蚕基因组中搜寻保守的家蚕miRNA分子,然后采用RT-PCR手段对预测结果进行验证,并观察它们在不同组织中的表达情况。现将研究结果小结如下:1.在数据库中共搜寻出62条保守的家蚕miRNA候选分子,通过mfold分析所有预测的miRNA序列是否能够形成符合miRNA标准的发夹环状二级结构。折叠结果表明,绝大多数序列能够形成典型的发夹结构。这些miRNA候选分子与已知黑腹果蝇的miRNA有着高度同源性。2.在研究家蚕miRNA分子中,发现在所预测的候选分子中有33个仅存在于节肢动物中的miRNA分子,如miR-965、miR-993和miR-1000。通过比对分析发现,它们的成熟序列和前体都较为保守。3.通过分析发现家蚕基因组中这62个与果蝇miRNA同源的序列形成40个基因家族。其中miR-2、miR-9、miR-25和miR-263家族分别有5、3、2和2个成员,而大多数miRNA家族,例如miR-305,miR-275,miR-iab-4家族都只有一个成员。这与植物miRNA形成家族的形式完全相反。动物家族成员之间通常是多拷贝或者是序列同源的。4.对所有的62个miRNA进行序列分析,发现其中20个miRNA分子形成8个基因簇。其中最大的基因簇由5个基因组成的。这些簇的序列比对表明,这8个miRNA簇都是由同源的miRNA分子所组成,且在黑腹果蝇中,这些分子也相应成簇。5.对所鉴定的miRNA靶序列的预测分析表明,这10个miRNA所调节的靶序列参与了家蚕生命活动中一些非常重要的过程,比如变态发育、细胞凋亡和信号转导作用等等。这些靶基因包括激素调控途径中的调控因子,如保幼激素酯酶等;细胞周期调控因子,如凋亡抑制蛋白等;以及信号传导调节因子,如凋亡信号调节激酶等。这些不同的靶分子显示了miRNA在细胞各种不同的生理活动中都扮演着重要的角色。6.通过对4条miRNA候选分子进行RT-PCR分析,发现miRNA在不同组织中存在着特异性表达情况,如miR-iab-4as,分析结果表明这些miRNA分子在家蚕生长发育过程中的存在着不同水平的表达。

关键词：微小RNA(microRNA) 非编码RNA 生物信息学家蚕