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作者：史艳秋东北农业大学

学位级别：硕士

本实验通过D-半乳糖诱导小鼠建立亚急性衰老实验动物模型，探讨衰老形成的机理，验证人参茎叶皂甙的抗衰老作用，探讨其对衰老小鼠脑组织的保护效应。 1．对2月龄雄性昆明小鼠每日颈背皮下注射D-半乳糖120mg／kg，连续40d，结果显示：... 详细信息

本实验通过D-半乳糖诱导小鼠建立亚急性衰老实验动物模型，探讨衰老形成的机理，验证人参茎叶皂甙的抗衰老作用，探讨其对衰老小鼠脑组织的保护效应。 1．对2月龄雄性昆明小鼠每日颈背皮下注射D-半乳糖120mg／kg，连续40d，结果显示：衰老组小鼠脑组织的MDA含量显著高于正常组(P＜0.01)，MAO-B活性显著升高(P＜0.01)，SOD、NOS与ATP酶活性显著降低(P＜0.01)，NO含量下降(P＜0.05)。形态学观察表明衰老组小鼠的脑皮层神经元固缩、核糖体解聚、胞浆内出现大量脂滴及脂褐素颗粒、染色质凝聚;胶质细胞肿胀、胞浆空化、突触减少、轴索内神经微丝溶解。说明：D-半乳糖诱发的拟衰老反应是建立衰老模型的可行途经。 2．在对小鼠进行D-半乳糖注射的同时，每日用人参茎叶皂甙50mg／kg和200mg／kg灌胃，用药40d。结果表明：适量的人参茎叶皂甙(50mg／kg)能显著减弱D-半乳糖导致的衰老作用，使衰老小鼠脑组织的MDA水平显著下降(P＜0.01)，脑SOD、NOS、ATP酶活性及NO含量显著升高(P＜0.05)，MAO-B的活性显著降低(P＜0.01)，电镜观察脑组织的超微结构有明显改善;而高剂量人参茎叶皂甙(200mg／kg)不能扭转D-半乳糖导致的衰老作用。揭示：人参茎叶皂甙具有双向调节作用，适量的人参茎叶皂甙可增强脑组织的抗氧化与能量代谢能力，降低自由基水平，调节神经递质代谢，延缓脑组织老化，对衰老小鼠脑组织具有明显的改善和保护作用。

关键词：衰老人参茎叶皂甙脑组织保护

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LacZ基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达

LacZ基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达

作者：田雷东北农业大学

学位级别：硕士

牛奶及其乳清中含有大量乳糖，世界上70％～90％的亚洲和非洲人喝牛奶后会产生乳糖不耐症。乳糖不耐症在很大程度上限制了人们对乳及乳制品的摄入，会产生一系列不良影响。用β-半乳糖苷酶将牛奶中的乳糖水解，产生低乳糖牛奶，可以使... 详细信息

牛奶及其乳清中含有大量乳糖，世界上70％～90％的亚洲和非洲人喝牛奶后会产生乳糖不耐症。乳糖不耐症在很大程度上限制了人们对乳及乳制品的摄入，会产生一系列不良影响。用β-半乳糖苷酶将牛奶中的乳糖水解，产生低乳糖牛奶，可以使乳糖不耐症得到缓解，并提高乳及乳制品的营养价值，同时去除了乳清浓缩时乳糖结晶析出给乳制品加工带来的不便。此外，用此水解物还可生产乳清饮料、糖浆、食品添加剂等。本研究旨在通过基因重组技术构建真核表达载体，使β-半乳糖苷酶基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达，并探索其不同时期的表达情况。目的在于进一步使β-半乳糖苷酶基因在奶牛乳腺中高水平表达，为今后制备转基因动物，生产转基因牛奶，改良牛奶品质提供可行的技术手段和可信的理论支持。另外，本研究所构建的真核表达载体含有报告基因lacZ的全部序列，其上游的调控序列两端带有限制性酶切位点，可为以后研究不同的真核基因调控序列提供方便可靠的模型。本研究从荷斯坦奶牛的乳腺组织中提取了基因组DNA，以此DNA为模板通过PCR技术克隆了牛αS1-酪蛋白基因的5’调控序列1195bp的片段。对此DNA片段进行序列测定，应用计算机软件DNAMAN6.0将它与GenBank发表的相应序列进行对比，发现同源率99.75％。应用基因重组技术在lacZ基因上游插入了获得的牛αS1-酪蛋白基因的5’调控序列，成功构建了真核表达载体gαslp-psv。用胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养，并用免疫荧光染色法测定了乳腺上皮细胞中角蛋白18的表达，从而鉴定出分离培养的细胞为奶山羊乳腺上皮细胞。用阳离子脂质体把载体gαslp-psv转入奶山羊乳腺上皮细胞，应用两种方法检测出β-半乳糖苷酶在奶山羊乳腺上皮细胞中获得表达。一种是细胞原位染色，β-半乳糖苷酶可以催化X-Gal分解，在普通光学显微镜下可以观察到培养细胞中生成深蓝色产物，因此可用于检测β-半乳糖苷酶在细胞中的表达。另一种方法是用Promega生产的Beta-Glo检测系统，检测转染后不同时期细胞培养液和细胞破碎液中的β-半乳糖苷酶的表达情况，从检测结果看出，在细胞培养液中，转染后24h可以检测到lacZ基因的表达，之后表达水平有逐渐升高的趋势，72h开始降低，144h降到最低;在细胞破碎液中，转染后24h表达水平最高，之后表达水平有逐渐降低的趋势，144h降到最低。实验证明，细胞表达的β-半乳糖苷酶为分泌性蛋白。转染细胞传代后的表达情况：转染细胞的第一代表达水平最高，之后随细胞传代表达水平降低，传到第三代时基本检测不到表达产物。

关键词：调控序列 β-半乳糖苷酶载体乳腺上皮细胞基因表达

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小鼠乳腺上皮细胞培养体系的建立及初步应用

小鼠乳腺上皮细胞培养体系的建立及初步应用

作者：张以涛东北农业大学

学位级别：硕士

体外培养系统可以模拟体内激素环境和体内构造来控制细胞的生长，还可以研究不同培养条件下细胞的生长潜能，既快捷又便利。小鼠作为实验动物的易获得性和可操作性是细胞水平研究乳腺的理想动物模型，而现有的小鼠乳腺上皮细胞的分离、... 详细信息

体外培养系统可以模拟体内激素环境和体内构造来控制细胞的生长，还可以研究不同培养条件下细胞的生长潜能，既快捷又便利。小鼠作为实验动物的易获得性和可操作性是细胞水平研究乳腺的理想动物模型，而现有的小鼠乳腺上皮细胞的分离、培养技术缺乏统一的操作规范，可重复性相对不足。因此，改进小鼠乳腺上皮细胞分离、培养技术及建立完善的新的体外培养体系已成为乳腺发育和功能研究的重要任务。Heregulin-α是细胞间信号蛋白，它可增强体外培养的乳腺上皮细胞对催乳素的敏感性，在乳腺上皮细胞形态发生、导管形成，以及诱导乳腺上皮细胞分化成分泌腺泡中扮演了重要角色，对乳腺发育和乳腺功能调控具有重要作用。本研究旨在建立完善的小鼠乳腺上皮细胞体外培养体系，探讨Heregulin-α对该体系乳腺上皮细胞增殖及代谢的影响，为进一步深入研究乳腺上皮细胞的形态、结构和功能，揭示Heregulin-α在小鼠乳腺发育中的作用及其规律提供重要理论依据。为寻求人工调控促进乳腺发育和乳腺功能的新方法和新途径，提高乳产量和乳质量，提供可行的技术手段和可信的理论支持。本研究采用胶原酶一步消化法、胰蛋白酶和胶原酶分段消化法分离培养小鼠乳腺上皮细胞，对比两种分离培养方法获得乳腺上皮细胞的形态。结果表明：采用胰蛋白酶和胶原酶分段消化法可以获得大量高纯度并且形态均一的乳腺上皮细胞。具有方法简便、易于操作等优点。本研究比较不同pH、不同血清浓度配比的生长培养液对小鼠乳腺上皮细胞生长的影响。结果表明：pH 7.4的含10％血清的培养基为最佳生长液。pH为6.8、7.6与pH为7.2、7.4的两组细胞数量均有显著差异(p＜0.01)，pH为7.2、7.4两组之间差异不显著(p＞0.05)。FBS为5％时与各组均差异显著(p＜0.01)，10％、15％之间差异不显著(p＞0.05)。本研究运用相差显微镜技术，采用MTT方法比较不同取材时期获得的乳腺上皮细胞生物学特性，结果揭示妊娠期细胞生存、增殖能力均强于泌乳期细胞，妊娠期小鼠乳腺为获得细胞的最佳取材时期。本研究采用免疫组化和RT-PCR(转录水平)方法分别对细胞重要的标志蛋白角蛋白-18和特异性分泌蛋白β-酪蛋白进行了鉴定，结果表明所获得的细胞为乳腺上皮细胞，并具有正常分泌乳蛋白的功能，成功建立小鼠乳腺上皮细胞体外培养体系。利用所建立的小鼠乳腺上皮细胞体外培养体系，采用液相色谱技术及MTT方法，初步探讨了Heregulin-α对小鼠乳腺上皮细胞的影响。结果表明：适宜量Heregulin-α对小鼠乳腺上皮细胞生长和分泌总蛋白、乳糖均有显著促进作用。0.1～20ng／ml的Heregulin-α可促进小鼠乳腺上皮细胞的增殖和总蛋白、乳糖含量的增加，20ng／ml时达到最大值(p＜0.01)，50ng／ml、100ng／ml Heregulin-α抑制小鼠乳腺上皮细胞的增殖，降低小鼠乳腺上皮细胞的总蛋白、乳糖含量(p＜0.05)。

关键词：小鼠乳腺上皮细胞细胞培养体系 Heregulin-α 生物学特性

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滑菇多糖的抗衰老生物学效应

滑菇多糖的抗衰老生物学效应

作者：崔英俊东北农业大学

学位级别：硕士

衰老是许多伴随年龄推进发生的连续改变的积聚，已有研究表明多种食药用真菌多糖均有抗衰老作用。本实验利用D-半乳糖建立衰老模型，首次观察了滑菇多糖对衰老模型鼠不同时期免疫功能、抗氧化能力的影响，以及组织形态学变化。实验结果... 详细信息

衰老是许多伴随年龄推进发生的连续改变的积聚，已有研究表明多种食药用真菌多糖均有抗衰老作用。本实验利用D-半乳糖建立衰老模型，首次观察了滑菇多糖对衰老模型鼠不同时期免疫功能、抗氧化能力的影响，以及组织形态学变化。实验结果表明： 1．滑菇多糖可以通过增强衰老模型鼠的免疫功能发挥抗衰老效应，有效提高衰老模型鼠的胸腺指数、脾指数和脾淋巴细胞转化率。　 2．滑菇多糖可以通过提高衰老模型鼠的抗氧化能力发挥抗衰老作用，提高衰老模型鼠肝脏的超氧化物岐化酶活力，增强肝脏抑制活性氧生成的能力，降低肝脏脂褐素的含量。 3．组织形态学观察发现，滑菇多糖对脾脏和肝脏在衰老过程中的退行性变化有明显改善作用。

关键词：滑菇多糖免疫功能超氧化物岐化酶脂褐素

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抗hTERT单链抗体的制备

抗hTERT单链抗体的制备

作者：王校东北农业大学

学位级别：硕士

近几年来,有关单链抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展较快。由于单链抗体分子量小、免疫原性低、组织穿透力强、特异性好,与单克隆抗体相比,在肿瘤的诊断和治疗方面展示了更好的应用前景。已发现大约85%的人类恶性肿瘤具有端粒酶活性,所... 详细信息

近几年来,有关单链抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展较快。由于单链抗体分子量小、免疫原性低、组织穿透力强、特异性好,与单克隆抗体相比,在肿瘤的诊断和治疗方面展示了更好的应用前景。已发现大约85%的人类恶性肿瘤具有端粒酶活性,所以抑制端粒酶为抗肿瘤药物的设计提供了新的目标。大量研究表明, 端粒酶抑制剂将成为一种有效的新型抗肿瘤药物。本实验通过抗端粒酶逆转录酶(hTERT)单克隆抗体制备hTERT的单链抗体,研究其在Lewis肺癌细胞中的抑制肿瘤生长作用。采用RT-PCR技术从能持续分泌抗端粒酶hTERT单抗的杂交瘤细胞中克隆出抗体的轻链、重链可变区基因VL、VH 。Overlap PCR将VL和VH用(Gly4Ser)4连接成hTERT的ScFv基因,连入原核表达载体pET19b,构建成pET19b-ScFv,转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。通过SDS-PAGE和Western-blot分析,能够很好地检测到单链抗体的生物学活性。再将ScFv基因连入真核表达载体pEGFP-C1,构建成pEGFP-C1-ScFv,转染肿瘤细胞,表明其具有一定的抑制肿瘤细胞生长的作用。

关键词：肿瘤免疫治疗单链抗体端粒酶逆转录酶(hTERT)

Pten基因对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的调节功能

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Pten基因对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的调节功能

作者：王卓然东北农业大学

学位级别：硕士

Pten基因作为一个肿瘤抑制基因,在多种细胞活动中发挥调节作用,包括细胞的增殖、粘附、凋亡等。目前国内外关于Pten基因在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。本研究以泌乳中期的奶牛乳腺上皮细胞为模型,探索Pten基因的表达... 详细信息

Pten基因作为一个肿瘤抑制基因,在多种细胞活动中发挥调节作用,包括细胞的增殖、粘附、凋亡等。目前国内外关于Pten基因在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。本研究以泌乳中期的奶牛乳腺上皮细胞为模型,探索Pten基因的表达与奶牛乳腺发育和泌乳之间的关系,目的在于揭示Pten基因在奶牛乳腺中的调节作用,为动物乳腺发育和泌乳调节机制的研究提供基础资料,为人工调控乳品质和乳产量提供理论依据。本研究以中国荷斯坦奶牛作为实验动物,应用荧光定量qRT-PCR、Western blotting和免疫组织化学技术,对奶牛不同发育阶段及不同乳品质的乳腺组织中Pten mRNA和蛋白质的相对表达量进行检测;以体外培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建重组质粒pGCMV-Pten-IRES-EGFP,对细胞进行瞬时转染,进行Pten基因过表达实验;应用RNA干扰的方法用Pten siRNA瞬时转染细胞,进行Pten基因抑制实验。分别用相关试剂盒检测Pten基因过表达和抑制之后细胞p-酪蛋白、甘油三酯以及乳糖分泌的情况,为了检测Pten基因对奶牛乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响,分别应用CASY-TT细胞分析仪和流式细胞仪检测细胞活性和细胞周期,采用荧光定量qRT-PCR和Western blotting技术,在mRNA和蛋白水平检测与泌乳相关的信号通路基因的表达变化;同时,添加外源性催乳素和葡萄糖培养细胞,检测培养液上清中β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的浓度,以及Pten基因的表达量变化,从而探索Pten基因在催乳素诱导的葡萄糖转化生成乳糖过程中的作用。研究结果表明,泌乳期Pten基因表达量显著低于干乳期。与泌乳期低乳品质(乳蛋白含量3.0%,乳脂含量>3.5%)的奶牛乳腺组织中Pten mRNA和蛋白表达水平分别降低了30%和40%;Pten基因过表达可抑制奶牛乳腺上皮细胞的活力、增殖能力以及β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的分泌量(P0.05)。催乳素的添加能促进细胞分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖(P0.05),同时Pten基因的表达量无明显改变(P>0.05)。综上所述,Pten基因参与调节奶牛乳腺上皮细胞泌乳的过程,负向调节细胞的活力、增殖能力和细胞周期,并能抑制奶牛乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖;这种调节作用是通过Pten基因靶向调节PI3K-AKT信号通路,进而调节其他泌乳相关信号通路基因的表达而实现的;同时发现Pten基因的表达受催乳素的负调节,但葡萄糖对Pten基因的表达水平无显著影响。

关键词：奶牛乳腺发育泌乳 Pten

奶山羊乳房炎的淋巴细胞与乳腺上皮细胞凋亡规律

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奶山羊乳房炎的淋巴细胞与乳腺上皮细胞凋亡规律

作者：杨庆丽东北农业大学

学位级别：硕士

乳房炎是奶牛和奶山羊最常见疾病之一，它不仅影响产奶量，降低经济效益，甚至影响到奶牛和奶山羊的泌乳功能，最终被迫淘汰。同时严重影响乳的质量，影响人体健康，危害极大。本研究以奶山羊为实验动物，检测泌乳期乳房炎奶山羊和不同... 详细信息

乳房炎是奶牛和奶山羊最常见疾病之一，它不仅影响产奶量，降低经济效益，甚至影响到奶牛和奶山羊的泌乳功能，最终被迫淘汰。同时严重影响乳的质量，影响人体健康，危害极大。本研究以奶山羊为实验动物，检测泌乳期乳房炎奶山羊和不同处理组(疫苗组、中药组、联合组)淋巴细胞及乳腺上皮细胞凋亡的变化，建立金黄色葡萄球菌诱导的隐性乳房炎模型，揭示外周血淋巴细胞凋亡与乳房内接菌时间的相关性，从细胞凋亡的角度研究乳房炎的发病机理，为乳房炎的预防和治疗提供可靠的依据。本研究运用流式细胞术，系统研究乳房炎和不同处理奶山羊外周血淋巴细胞凋亡变化规律。结果表明，奶山羊外周血淋巴细胞凋亡率(％)乳房炎组显著高于其它各组(P＜0.01，P＜0.05);疫苗组显著低于乳房炎组(P＜0.01);中药组显著低于对照组(P＜0.01，P＜0.05);联合组显著低于疫苗组(P＜0.01，P＜0.05)，与中药组无显著差异(P＞0.05)。本研究运用流式细胞术，系统研究乳房炎和不同处理奶山羊脾淋巴细胞凋亡变化规律。结果表明，脾淋巴细胞凋亡率(％)乳房炎组显著高于其它各组(P＜0.01，P＜0.05);疫苗组显著低于乳房炎组(P＜0.01);中药组显著低于对照组(P＜0.01，P＜0.05);联合组显著低于疫苗组(P＜0.01，P＜0.05)，与中药组无显著差异(P＞0.05)。本研究运用流式细胞术，系统研究乳房炎和不同处理奶山羊乳上淋巴结淋巴细胞凋亡变化规律。结果表明，乳上淋巴结淋巴细胞凋亡率(％)乳房炎组显著高于其它各组(P＜0.01);疫苗组显著低于乳房炎组(P＜0.01，);中药组显著低于对照组(P＜0.01，P＜0.05);联合组显著低于疫苗组(P＜0.01，P＜0.05)，与中药组无显著差异(P＞0.05)。本研究运用流式细胞术，系统研究乳房炎和不同处理奶山羊肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡变化规律。结果表明，肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡率(％)乳房炎组显著高于其它各组(P＜0.01);疫苗组显著低于乳房炎组(P＜0.01，P＜0.05);中药组显著低于对照组(P＜0.01，P＜0.05);联合组显著低于疫苗组(P＜0.01，P＜0.05)，与中药组无显著差异(P＞0.05)。本研究运用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)，研究乳房炎和不同处理奶山羊乳腺上皮细胞凋亡变化情况。结果表明，乳腺上皮细胞凋亡乳房炎组显著高于其它各组(P＜0.01);疫苗组显著低于乳房炎组(P＜0.01，P＜0.05);中药组显著低于对照组(P＜0.01，P＜0.05);联合组显著低于疫苗组(P＜0.01，P＜0.05)，与中药组无显著差异(P＞0.05)。本研究建立了金黄色葡萄球菌诱导的奶山羊隐性乳房炎模型，接菌0～36h外周血淋巴细胞凋亡率(％)显著升高，36～96h略有回落，96～504h保持稳定。

关键词：乳房炎淋巴细胞乳腺上皮细胞细胞凋亡流式细胞术

山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建

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山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建

作者：张莉东北农业大学

学位级别：硕士

当前畜牧业生产中所使用的卵泡刺激素(FSH)产品都是从牛、羊、猪等家畜的脑垂体中直接提取的，由于材料来源有限、纯度差且常有其它激素的污染，影响了FSH的广泛应用。用基因工程方法可大量生产高纯度的FSH，降低生产费用，这对畜牧业... 详细信息

当前畜牧业生产中所使用的卵泡刺激素(FSH)产品都是从牛、羊、猪等家畜的脑垂体中直接提取的，由于材料来源有限、纯度差且常有其它激素的污染，影响了FSH的广泛应用。用基因工程方法可大量生产高纯度的FSH，降低生产费用，这对畜牧业生产具有重要意义。本试验是从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA，反转录获得cDNA，以此cDNA为模板，PCR扩增目的基因片段，分别获得长为360bp的山羊FSH-α亚基DNA片段和长为390bp的山羊FSH-β亚基DNA片段，与预期的目的基因片段大小一致。将它们分别克隆至pMD 18-T，随机挑选几个阳性重组子进行测序。将测序结果与绵羊等多种哺乳动物该基因及相应的氨基酸进行同源性比较、分析。结果显示山羊FSH-α、β亚基基因及其各自对应的氨基酸与其他哺乳动物的同源性都非常高，一般均在80％以上，验证了在同一种内，甚至在所有的哺乳动物中FSH-α亚基是极为保守的;而FSH-β亚基尽管具有种属特异性，但也是相当保守的。将所得的山羊FSH-α、β亚基基因分别用加相应限制性内切酶酶切位点的引物大量扩增，回收后与pMD 18-T连接，筛选出阳性重组子，大量双酶切回收获得带粘性末端的山羊FSH-α、β亚基基因，将它们分别与同两个酶大量双酶切回收获得的带粘性末端的PF质粒进行连接，筛选阳性重组子。依此方法分别构建了FSH单亚基真核表达载体gFSH-α-PF、gFSH-β-PF和FSH双亚基真核表达载体gFSH-α-β-PF、dFSH-α-gFSHβ-PF。本研究首次进行了山羊FSH的基因克隆、序列分析及表达载体构建方面的探索，填补了国内外重组山羊FSH基础研究的空白，为今后重组山羊FSH的大量生产应用提供了理论基础和实验依据。

关键词：山羊卵泡刺激素基因克隆序列分析表达载体构建

奶牛乳腺中调控乳品质的miRNA及其靶基因

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奶牛乳腺中调控乳品质的miRNA及其靶基因

作者：金晶东北农业大学

学位级别：硕士

奶牛的乳品质由多因素调节控制,近年来发现非编码RNA可能参与奶牛的泌乳调控。本研究以中国荷斯坦奶牛乳腺作为实验材料,应用small RNA测序(small RNA-seq)技术结合RNA交联免疫沉淀测序(CLIP-Seq)技术研究和鉴定与乳品质相关的miRNAs和... 详细信息

奶牛的乳品质由多因素调节控制,近年来发现非编码RNA可能参与奶牛的泌乳调控。本研究以中国荷斯坦奶牛乳腺作为实验材料,应用small RNA测序(small RNA-seq)技术结合RNA交联免疫沉淀测序(CLIP-Seq)技术研究和鉴定与乳品质相关的miRNAs和它们调控的关键靶基因。(1)应用small RNA-seq技术分离和鉴定与乳品质调控相关候选miRNAs本实验将不同乳品质中国荷斯坦奶牛的乳腺组织分为泌乳期高乳品质实验组(H)和泌乳期低乳品质实验组(L),首先应用小RNA高通量测序技术筛查不同实验组乳腺组织miRNAs的表达情况,同时应用mi REvo和mirDeep2这2个miRNA预测软件对测序获得的新序列进行分析,结果显示56个miRNA在不同乳品质奶牛组织差异表达(P<0.05,FDRq<0.05);继而应用生物信息学方法对差异表达miRNAs进行靶基因预测并对靶基因进行GO和信号通路富集分析。在生物信息学靶基因筛选结果中,我们发现4个已报道的与乳蛋白、乳脂肪合成紧密相关的miRNA调控的靶基因CSN3、SCD、LALBA和DGAT2。预测miRNA靶基因聚集的生物学功能多数参与蛋白质和脂肪代谢、乳腺发育分化和免疫功能,这些靶基因主要富集在MAPK信号通路、甘油磷酸脂质代谢、缺氧诱导因子1和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号转导通路。结果提示调控乳品质的miRNAs主要通过靶向糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢、细胞凋亡以及免疫相关通路的基因而发挥作用。(2)应用RNA结合蛋白免疫共沉淀和CLIP-Seq技术验证与乳品质相关miRNA调控的靶基因为验证生物信息学方法预测的乳品质相关miRNA靶基因的结果,继续将泌乳期高乳品质奶牛(H)和泌乳期低乳品质奶牛(L)的乳腺组织作为实验对象,应用RNA结合蛋白免疫共沉淀技术和CLIP-Seq技术进行分析,实验获得81个由miRNA调控的差异表达靶基因(P<0.05,FDRq<0.05),同时对81个miRNA调控的差异表达靶基因进行GO分析和通路分析,结果显示这些基因主要参与蛋白质代谢、脂肪代谢、乳腺发育等生物过程。(3)生物信息靶基因分析结果和验证实验结果的整合分析将生物信息靶基因分析结果和验证实验结果进行整合分析,共筛选到26个交集靶基因,并且对与乳脂肪和乳蛋白有关的6个基因画了miRNA-基因-通路和miRNA-基因-功能的互作网络图,发现其中6个靶基因(FABP3、TGFβ3、CACNA1G、ACSM1、GSS和CHAD)是乳蛋白与乳脂肪代谢重要候选基因;bta-mi R-423-3p、bta-mi R-2449、bta-mi R-2378、bta-mi R-2382*、bta-mi R-3604和bta-mi R-324调控这6个靶基因,说明了这几个miRNA是很关键的。

关键词：奶牛乳品质 miRNA 靶基因

奶牛乳腺上皮细胞胰岛素样生长因子及受体IGF-IR的表达及作用

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奶牛乳腺上皮细胞胰岛素样生长因子及受体IGF-IR的表达及作用

作者：张童非东北农业大学

学位级别：硕士

奶牛是畜牧养殖业中的重要经济动物,可产生大量的乳,乳产量和乳质量对人民的生活有很大影响。奶牛乳腺发育、泌乳及退化受到生长因子等诸多因素的调控,其中胰岛素样生长因子（IGFs）及其受体（IGFR）就对奶牛乳腺发育和乳腺功能起到非... 详细信息

奶牛是畜牧养殖业中的重要经济动物,可产生大量的乳,乳产量和乳质量对人民的生活有很大影响。奶牛乳腺发育、泌乳及退化受到生长因子等诸多因素的调控,其中胰岛素样生长因子（IGFs）及其受体（IGFR）就对奶牛乳腺发育和乳腺功能起到非常重要的调节作用。本研究的目的在于揭示IGFs及其受体的表达与奶牛乳腺发育与泌乳之间的关系,以及IGF-I调控IGF-IR表达的分子机制,为奶牛乳腺发育和泌乳机制研究提供基础资料,为人工调控乳产量和乳质量提供可行的技术手段与可信的理论支持。本研究以荷斯坦奶牛为实验材料,应用荧光定量RT-PCR技术检测奶牛乳腺组织中不同发育阶段Igf-Ⅰ、Igf-Ⅱ、Igfbp5及Igf-Ir mRNA的表达;以体外培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞为模型,应用光定量RT-PCR、Western blotting技术,确定IGF-I与IGF-IR表达之间的关系,检测胰岛素样生长因子受体Igf-Ir基因瞬时沉默对IGF-IR蛋白、Akt蛋白、P-70s6K蛋白和Cyclin D1蛋白表达及泌乳功能的影响。研究结果表明,Igf-Ⅰ、Igf-Ⅱ、Igfbp5及Igf-Ir mRNA在奶牛乳腺发育的不同时期均有表达,但不同时期的表达量有所变化。Igf-I和Igf-Ⅱ mRNA青春期和妊娠期表达量显著高于其它发育时期（P≤0.05）;Igf-Ir mRNA在围产期表达量最大（P＜0.05）,其他时期也均有表达;Igfbp5mRNA在青春期表达量最高（P＜0.05）。实验用组织块培养法成功获取了泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞,不同浓度IGF-I处理细胞后,荧光定量RT-PCR结果表明,Igf-Ir mRNA、β-casein mRNA的表达量和细胞增殖水平显著上升（P＜0.05）,且在一定范围内,对IGF-I存在剂量依赖效应。利用siRNA干扰技术,成功建立了Igf-Ir基因沉寂细胞模型,Western blotting检测表明,Igf-Ir基因沉寂后IGF-IR蛋白、Akt蛋白、P-70s6K蛋白的表达量显著低于空白组、IGF-I处理组和IGF-I+干扰组（P＜0.05）,而CyclinD1蛋白表达与空白组和IGF-I+干扰组无差异（P＞0.05）;乳腺上皮细胞增殖能力及β-Casein的合成能力均显著下降（P＜0.05）。 Igfs及其受体Igf-Ir mRNA表达量的变化揭示了胰岛素样生长因子及受体参与了奶牛乳腺发育和泌乳的调控。Igf-Ir的表达在一定范围内对IGF-I有剂量依赖效应,且Igf-Ir影响信号通路Akt、P-70s6K蛋白的表达,揭示IGF-IR受体信号通路介导乳腺上皮细胞增殖和泌乳相关基因和蛋白的表达。

关键词：奶牛乳腺上皮细胞 IGFs IGF-IR RNA干扰