检索结果-南通市图书馆

作者：姚巧缤厦门大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses,HPV)属于乳头瘤病毒科、乳头瘤病毒属,是一类具有蛋白衣壳的双链DNA病毒。HPV病毒可分为200多个亚型,高危型HPV的感染将大大增加女性罹患宫颈癌的概率。宫颈癌号称女性第二大杀手,仅次于乳腺癌对... 详细信息

人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses,HPV)属于乳头瘤病毒科、乳头瘤病毒属,是一类具有蛋白衣壳的双链DNA病毒。HPV病毒可分为200多个亚型,高危型HPV的感染将大大增加女性罹患宫颈癌的概率。宫颈癌号称女性第二大杀手,仅次于乳腺癌对女性的杀伤力。另外,HPV的感染也可能导致生殖器癌、口腔癌、咽喉癌,及生殖器疣等疾病的产生。L1蛋白HPV病毒上的主要衣壳蛋白,占HPV衣壳蛋白总比例的80%至90%,能自组装成类病毒颗粒,具有良好的免疫原性。现上市的HPV疫苗均以L1的类病毒颗粒为基础研制。但L1蛋白具有较强的型别特异性,对研发广谱的HPV疫苗造成了一定的困难。L2蛋白是HPV病毒上的次要衣壳蛋白,与病毒感染、入核、以及成熟后组装等过程有关。L2蛋白上含有HPV的广谱综合表位,且型别特异性较小,具有诱导机体产生交叉综合抗体、提供交叉保护的潜能。因此,解析L2蛋白的结构对更深入地研究HPV的感染机制以及研发HPV的广谱疫苗具有重要的意义。为了研究L2的结构与功能,本研究首先开展了在杆状系统中表达L1与L2相互作用的VLPs的工作。分别通过共感染与共表达路径进行表达,此时的L1与L2蛋白上均不含相互作用位点。经鉴定,两条路径表达的VLPs均由L1蛋白组成,未鉴定到L2蛋白的存在。通过细胞沉淀中的包涵体鉴定发现,L2蛋白存在于包涵体中。由此能够推论:L1、L2蛋白在昆虫细胞中同时表达后,未能有效相互作用。后续本研究在L1与L2上分别引入了半胱氨酸点突变,期望两个半胱氨酸位点能形成二硫键,增强相互作用。随后将蛋白L1-Q317C与L2-E338C同时表达,结果显示,在共感染路径表达的VLPs中,可检测到L2蛋白,但含量极少。本研究继续通过HPLC比较了不同VLPs的出峰时间并推论出,发现颗粒中L2的含量虽少,却能增大VLPs的直径。相互作用位点的引入是具有一定的效果。免疫原性评价的结果显示,此VLPs的免疫未能诱发小鼠体内产生高滴度的L2中和抗体。这可能与L2在HPV大部分的生命周期中均存在于五聚体内部、极少暴露中和位点有关。由于上述获得的VLPs并不均一,不利于冷冻电镜结构解析,本研究进行了L1与L2蛋白相互作用的五聚体的表达工作。经SDS-PAGE/WB/HPLC/TEM鉴定后,确认可在杆状系统中表达经175位与428位双点突变的16L1蛋白,且此蛋白具有自组装形成HPV-L1五聚体的能力。除了L2-E338C,我们根据本实验室其他课题方向的研究结果,在L2蛋白上引入了新的突变位点——T421C,以期能更好地加强L1与L2蛋白的相互作用。但从鉴定结果发现,旧相互作用位点与新相互作用位点的作用效果均不明显,共表达L1与L2形成的五聚体中不含L2蛋白。第三部分,本研究通过截短表达L2部分功能域蛋白。第一轮截短后,本研究首先通过Co柱对截短的L2蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,洗脱样品中杂蛋白含量太高,难以用于结构解析及疫苗生产。本研究继续尝试第二轮的L2蛋白的截短,使用不同的载体和截短长度,最后用Co柱对其中六个截短蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,L2-140-340蛋白具有最佳的纯化效果,洗脱样品中杂蛋白较少,L2含量很高,纯度较高,可能以三聚体或单体的形式存在。后续将继续研究该截短L2蛋白的生物性质和活性,获得均一的L2蛋白用于结晶和结构解析。

关键词：人乳头瘤病毒(HPV) 次要衣壳蛋白L2 杆状病毒-昆虫细胞表达系统相互作用 L2截短蛋白

人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选

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人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选

作者：王致萍厦门大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)主要感染人体皮肤和粘膜组织,引起增生性病变甚至恶性肿瘤。高危型别的HPV的长期感染是引发宫颈癌、肛门癌、头颈癌、口咽癌等恶性肿瘤的主要诱因。全球每年约57万宫颈癌新发病例,死亡病例高达3... 详细信息

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)主要感染人体皮肤和粘膜组织,引起增生性病变甚至恶性肿瘤。高危型别的HPV的长期感染是引发宫颈癌、肛门癌、头颈癌、口咽癌等恶性肿瘤的主要诱因。全球每年约57万宫颈癌新发病例,死亡病例高达31.1万例。目前宫颈癌的治疗手段有限,手术切除对人体伤害较大且有复发的风险,因此,开展HPV治疗性疫苗的研究刻不容缓。癌蛋白HPV E6和E7在肿瘤发生发展进程中起关键作用,被认为是干预和治疗的关键靶分子,因此对癌蛋白E6和E7的结构和功能展开深入的研究具有十分重要的意义。本研究分别利用原核表达系统和真核表达系统等多途径对HPV E6和E7蛋白的上清可溶性表达进行了探索,最终在pTO-T7载体上取得突破,经过密码子优化、表达菌株、洗脱条件和储存缓冲液等条件的探索和优化,克服了癌蛋白E7在原核表达系统中易聚集沉淀的难题,建立了一套稳定的表达纯化体系,获得了纯度90%以上、均一性和稳定性均良好的HPV18 E7蛋白,并对其展开了单克隆抗体的筛选,共获得55株与HPV18 E7蛋白具有良好反应性的单抗细胞株。本研究进一步对其中26株反应性优良的单抗细胞株展开抗体纯化和性质鉴定工作,包括抗体亚型、抗原抗体反应性、线性及构象和型特异性等。建立了HPV18 E7单抗盘,并且获得了1株反应性良好的型特异性构象抗体9A5、6株反应性良好的型特异性线性抗体(2E8、14E5、17F2、17F3、8A7、5C5、18E7和3B5)、1株反应性较弱的型特异性构象抗体(18E6)、6株两型交叉抗体(1A12、4A10、8E6、17A3、14A6和11E8)和1F6这株六型交叉线性抗体。综上,本研究建立了HPV18致癌蛋白E7可溶性表达和纯化体系,获得了高纯度且性质稳定的HPV18 E7蛋白并建立了单抗盘,为后续开展HPV18 E7蛋白结构解析、功能研究和治疗性疫苗或药物开发奠定了坚实的基础。

关键词：人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7 可溶性表达单克隆抗体

2011-2015年重庆地区轮状病毒分子流行病学调查

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2011-2015年重庆地区轮状病毒分子流行病学调查

作者：曾渊君厦门大学

学位级别：硕士

A组轮状病毒(Rotavirus)是引起全球婴幼儿严重腹泻的主要病因,95%的儿童在5岁以前都感染过轮状病毒,造成了巨大的经济和社会负担。目前尚无特效药物治疗轮状病毒引起的婴幼儿腹泻,疫苗接种是预防和控制轮状病毒感染的有效方法。轮状病... 详细信息

A组轮状病毒(Rotavirus)是引起全球婴幼儿严重腹泻的主要病因,95%的儿童在5岁以前都感染过轮状病毒,造成了巨大的经济和社会负担。目前尚无特效药物治疗轮状病毒引起的婴幼儿腹泻,疫苗接种是预防和控制轮状病毒感染的有效方法。轮状病毒的流行具有明显的地域性,且主要流行毒株随着时间的推移而不断变化。轮状病毒流行病学监测对于了解轮状病毒的进化以及研发高效的轮状病毒疫苗具有重要的指导意义。本研究收集了 2011-2015年重庆医科大学附属儿童医院门诊就诊的5岁以下婴幼儿腹泻标本2236份,其中轮状病毒是导致腹泻的主要病原体之一,轮状病毒阳性病例占所有腹泻病例的30.46%。681例轮状病毒阳性的患者中,12-24月龄儿童的轮状病毒检出率最高(42.32%),2岁以内儿童608名,占全部轮状病毒腹泻患儿的89.28%。轮状病毒在全年呈散发存在,以秋冬季节为多,在每年的10月份至次年一月份检出率较高,占全部轮状病毒腹泻患儿的83.36%(587/681)。2011-2015年重庆地区优势流行G基因型发生了从G1到G9的转变,P基因型则相对比较稳定,一直以P[8]基因型为主。基因型组合主要以G9P[8](43.53%)为主,其次为 G1P[8](30.21%),G3P[8](16.70%)和 G2P[4](6.19%)。在681份标本中,未发现人源毒株与动物源毒株的基因重配现象,但是,通过全基因组测序发现一例目前尚未报道的罕见的三基因重配毒株,其全基因序列分型结果:G1-P[4]-12-R1-C1-M1-A2-N2-T1-E1-H1,进化树和 simplot 软件分析表明该毒株可能来源于Wa-like与DS-1like毒株的重配。综上所述,中国大陆地区轮状病毒的流行复杂多变,应继续加强轮状病毒感染的监测,为研制和引进疫苗提供背景资料,为轮状病毒肠炎防治策略的制定提供参考依据。

关键词：轮状病毒流行病学 G9P G1P 疫苗腹泻

嵌合HEV表位的HBcAg颗粒在毕赤酵母中的分泌表达

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嵌合HEV表位的HBcAg颗粒在毕赤酵母中的分泌表达

作者：章建楠厦门大学

学位级别：硕士

毕赤酵母是近年来发展迅速,应用广泛的真核表达系统,能对蛋白进行良好的翻译后修饰,如信号肽加工、蛋白折叠、二硫键形成、部分脂基化和O-连接和N-连接糖基化修饰等。此外,毕赤酵母可以分泌表达外源蛋白,由于其自身胞外分泌的蛋白量很低... 详细信息

毕赤酵母是近年来发展迅速,应用广泛的真核表达系统,能对蛋白进行良好的翻译后修饰,如信号肽加工、蛋白折叠、二硫键形成、部分脂基化和O-连接和N-连接糖基化修饰等。此外,毕赤酵母可以分泌表达外源蛋白,由于其自身胞外分泌的蛋白量很低,与胞内表达外源蛋白的方法相比,没有细胞破碎过程中的细胞内溶物的释放以及所带来的细胞碎片的分离等问题,具有易于分离纯化、下游工艺简单等优点。戊型肝炎是由戊型肝炎病毒（HEV）引起的一种世界性的危害严重的传染病,主要流行于亚洲、非洲和墨西哥等地区。HEV基因组含3个开放读码框架（ORF）,其中ORF2编码660个氨基酸的肽链,为病毒主要结构蛋白。经研究发现,ORF2aa423-438在介导病毒与宿主细胞的结合中起重要作用,是12A10单克隆抗体的识别表位。乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）是一种良好的免疫载体,在原核和真核表达系统中均能自我组装成颗粒。当外源表位插入其MIR区时,仍可以形成颗粒,并且外源表位暴露在颗粒的表面,得到充分的展示。本研究将融合12A10表位肽的HBcAg的基因导入毕赤酵母中,构建工程菌株,进行分泌表达,优化了重组菌株的培养条件,并对纯化后的蛋白进行性质分析,验证了融合蛋白上的12A10表位有良好的免疫原性,探讨了HEV表位疫苗的可行性,为酵母分泌表达蛋白颗粒提供了一个很好的范例。首先,将嵌合有HEV受体相关表位12A10的HBcAg基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-HBc149-12A10,用内切酶SacI将其线性化后电转入毕赤酵母菌株GS115中。用G418筛选得到高抗性的转化子经过培养和甲醇诱导,培养上清进行SDS-PAGE电泳,与对照GS115/pPIC9k比较,在22kD处有一条差异蛋白带;通过Western Blot鉴定,该条带与单抗12A10有特异性反应。其次,用MGY/MM、BMG/BMM和BMGY/BMMY三组培养基进行重组菌株的培养,间接法ELISA表明,BMGY/BMMY明显优于其他两组培养基。以BMGY/BMMY培养基为基础,进行诱导温度、诱导甲醇浓度和诱导初始pH值的单因子实验。在以上实验的基础上,通过正交试验进一步优化培养条件,得到最佳诱导条件:初始pH值为7.0,甲醇浓度为1.0%,诱导温度为25℃。培养上清液通过切向流浓缩、更换缓冲液后,进行疏水层析纯化。最后,CsCl等密度梯度离心测得分泌出来的重组蛋白的密度为1.32g/ml。透射电镜观察显示,纯化的重组蛋白为均一的直径30nm左右的空心颗粒。小鼠免疫实验表明,纯化颗粒免疫8周后鼠血清中的特异性12A10抗体滴度可达到1.6×10~5。与含有12A10表位的p239重组颗粒的免疫原性相比,产生12A10特异性抗体水平有明显的提高,提示重组颗粒较好地呈递了HEV受体相关的非免疫优势表位。在本研究中,首次构建了能够分泌表达携带有表位多肽的HBcAg蛋白颗粒的毕赤酵母工程菌,为毕赤酵母胞外分泌表达其它大尺度的重组病毒颗粒提供了参考,为研究携带表位多肽的颗粒载体的疫苗提供了范例,为克服酵母胞内表达出现的难以纯化的难题提供了新的途径。

关键词：乙肝病毒核心抗原融合蛋白毕赤酵母分泌表达

肠道病毒71型（EV71）与柯萨奇病毒A组16型（CA16）单克隆抗体治疗的可行性评价

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肠道病毒71型（EV71）与柯萨奇病毒A组16型（CA16）单克隆抗体治...

作者：李志群厦门大学

学位级别：硕士

肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇病毒A组16型(CA16)是引起儿童手足口病(HFMD)的主要病原体。近些年来,手足口病在我国的发病率逐年上升,由手足口病导致的重症感染和死亡人数也明显增加,严重危害了儿童的生命安全,因此急需有效的治疗性药物... 详细信息

肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇病毒A组16型(CA16)是引起儿童手足口病(HFMD)的主要病原体。近些年来,手足口病在我国的发病率逐年上升,由手足口病导致的重症感染和死亡人数也明显增加,严重危害了儿童的生命安全,因此急需有效的治疗性药物来治疗并控制其感染与流行。单克隆抗体由于具有毒性低、特异性高等优点,是治疗病毒性感染的良好的候选药物。本研究的目的为优化EV71的小鼠攻毒模型同时建立稳定的CA16小鼠感染模型,并利用动物模型筛选和评价具有治疗潜力的EV71及CA16治疗性单抗,为开展EV71及CA16治疗性药物研制提供基础。本研究首先对原有的EV71动物模型的攻毒方式和攻毒剂量进行了优化,使该模型能够达到稳定的100%致死率。同时利用13株CA16临床分离株对1日龄新生鼠进行攻毒评价,结果发现大多数CA16病毒对小鼠表现出了强毒力,攻毒小鼠表现出瘫痪和肢体麻痹等神经症状。病理学检测显示攻毒小鼠的大脑和脊髓等部位出现了严重的坏死与炎症,与CA16在人体内的感染情况极为相似。基于上述结果,本研究建立了通过灌胃注射CA16感染1日龄BALB/c小鼠的CA16小鼠感染模型,为开展后续研究提供了重要基础。本研究应用所建立的CA16攻毒模型对CA16中和单抗的体内治疗效果进行评价,并根据体内外实验的结果确立了一株候选的CA16中和单抗14B10。通过评价感染CA16后不同治疗时间点及治疗策略的效果发现,14B10在攻毒后2天内进行单针治疗能够达到超过90%的治疗存活率,而利用三针治疗方案则能够在攻毒后第3天、即小鼠开始发病前1天有效治疗小鼠,从而证实了14B10对CA16的感染具有良好的体内治疗能力。本研究进一步应用EV71攻毒模型对13株EV71中和单抗的体内治疗能力进行筛选评价,从而确立了一株EV71中和单抗CT11F9。通过对攻毒EV71后不同治疗时间和治疗策略的评价发现,CT11F9在攻毒后三天内进行单针治疗能够达到100%的存活率及健康率,而利用三针治疗方案则能够在攻毒后第4天、即小鼠开始发病时有效提高小鼠的存活率,且对瘫痪小鼠具有一定的治疗能力。通过与人血清的阻断ELISA实验发现,CT11F9识别的表位在人血清中是免疫优势的。至此证实了CT11F9对EV71感染具有良好的体内治疗能力。综上所述,本研究优化了原有的EV71动物模型的攻毒参数并建立了稳定的CA16小鼠感染模型,利用该模型成功筛选并获得了对EV71或CA16感染具有良好治疗能力的中和单抗。这些研究为研发EV71及CA16治疗性抗体提供了重要的数据支持与理论基础。

关键词：肠道病毒71型柯萨奇病毒A组16型动物模型治疗性抗体

氨基酸对铝佐剂的增强免疫反应和调节Th1/Th2免疫平衡的初步研究

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氨基酸对铝佐剂的增强免疫反应和调节Th1/Th2免疫平衡的初步研究

作者：任丽洁厦门大学

学位级别：硕士

铝佐剂是使用历史最悠久的一种佐剂,具有丰富的安全性和有效性数据。然而随着疫苗技术的不断发展,传统铝佐剂已经无法满足日益复杂的佐剂需求,加上铝佐剂本身也存在Th2类反应偏倚的缺陷,因此探索新的佐剂系统是十分必要的。目前,联合铝... 详细信息

铝佐剂是使用历史最悠久的一种佐剂,具有丰富的安全性和有效性数据。然而随着疫苗技术的不断发展,传统铝佐剂已经无法满足日益复杂的佐剂需求,加上铝佐剂本身也存在Th2类反应偏倚的缺陷,因此探索新的佐剂系统是十分必要的。目前,联合铝佐剂和Toll样受体激动剂形成组合佐剂系统成为一种理想的优化策略,并且已经有了许多成功案例。受到这种优化策略的启发,本研究选择氨基酸这一类广泛存在于人体内并参与某些重要生理功能的分子,利用结构基团配位体交换与铝佐剂形成复合铝基佐剂或者作为一种添加剂以达到优化目的,然后对这些佐剂的理化性质以及免疫增强活性做出评估,以筛选出可以提高Th1类免疫的潜力分子以及铝佐剂优化组合。研究发现复合铝牛磺酸佐剂的理化性质与铝佐剂相近,蛋白吸附率高达95%以上,且对蛋白的构象稳定性有一定提升作用,佐剂联合重组新型冠状病毒S蛋白或其他非颗粒型蛋白免疫小鼠能诱导高效的抗体反应。此外,研究还发现谷氨酸作为铝佐剂添加剂时可以诱导高效的抗体反应并且具有量效关系,而且能诱导产生更高比例的分泌INF-γ的Th细胞。本研究通过评估一系列氨基酸分子对铝佐剂的免疫增强活性,证明部分氨基酸分子(如谷氨酸)可作为促进Th1和Th2免疫平衡的潜力分子,为后续优化铝佐剂的研究提供可靠的研究思路和丰富的数据支持。

关键词：疫苗佐剂复合佐剂谷氨酸牛磺酸 Th1/Th2免疫平衡

基于记忆B细胞体外刺激培养的Anti-HBsAg食蟹猴单克隆抗体筛选及性质初步鉴定

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基于记忆B细胞体外刺激培养的Anti-HBsAg食蟹猴单克隆抗体筛选及...

作者：王一文厦门大学

学位级别：硕士

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是全球主要的公共卫生问题之一,目前,全球约有2.4亿人为慢性乙肝感染者,每年约有60多万人死于慢性乙肝导致的肝硬化、肝癌等疾病。现有的基于干扰素和核(苷)酸类似物的治疗尚不能根治乙肝。本... 详细信息

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是全球主要的公共卫生问题之一,目前,全球约有2.4亿人为慢性乙肝感染者,每年约有60多万人死于慢性乙肝导致的肝硬化、肝癌等疾病。现有的基于干扰素和核(苷)酸类似物的治疗尚不能根治乙肝。本实验室前期在Gut期刊上报道了一株针对慢乙肝的治疗性鼠源单克隆抗体E6F6及其识别的核心靶点(HBsAg-aa119-125、SA线性表位),并基于该靶点设计出乙肝治疗性表位疫苗。本研究拟从单克隆抗体水平对该疫苗介导的体液免疫反应进行初步研究。由于非人灵长类(Non-Human Primate,NHP)与人的免疫球蛋白基因高度同源,接种疫苗后可以激起相似的免疫反应,常被用作疫苗评估的动物模型,本研究选择食蟹猴作为上述疫苗评估的模型。本研究初步建立了食蟹猴记忆B细胞体外刺激培养体系并对上述表位疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体及其功能和识别表位进行初步探索,其结果为该治疗性疫苗的评估提供参考。研究内容共分为以下四个部分:第一,基于记忆B细胞体外刺激培养的猴源抗体筛选系统的初步建立及HBsAg特异性猴抗筛选。本研究首先在原有的人记忆B细胞体外刺激培养体系的基础上,对食蟹猴记忆B细胞分选和刺激培养条件进行了初步确定,即采用人PanB和人IgM、人IgD两种负选磁珠联用的方式进行记忆B细胞的分选;记忆B细胞按起始培养数(5-10)个/孔和104个/孔的CD40L饲养细胞共同培养至含10%FBS、50 ng/mL hIL21的RPMI 1640培养基,该体系可以有效的刺激记忆B细胞分化为浆细胞;其次我们进一步验证了文献报道抗体扩增引物的有效性。利用该系统,从28个阳性培养孔中克隆出10株HBsAg阳性抗体。第二,HBsAg阳性抗体的功能评估。评估结果显示,5株抗体1-12H4、1-23、3-13、3-23H1、3-23H4与HBsAg具有较优的抗原结合活性且能被E6F6(针对HBsAg SA线性表位的鼠抗)明显阻断,同时这些抗体在HBV转基因鼠中都显示出明显的HBsAg和HBV DNA清除效果,其中1-23和3-23H1的病毒清除能力最为显著。第三,猴源抗体的进一步人源化改造及性质鉴定。利用IMGT数据库,将1-23和3-23H1抗体轻重链可变区的骨架(Framewrok region,FR)的非人源氨基酸定点突变为人源氨基酸,并最终通过性质评估筛选性质较优的人源化抗体。进一步对这些人源化的抗体进行性质鉴定,参比亲本抗体及E6F6人源化抗体(162),最终选出人源化程度为98.33%的M1D(亲本抗体1-23)及人源化程度为97.78%的M3D(亲本抗体3-23H1),这两株抗体很好地保留了亲本抗体的抗原结合及体内抗原清除能力。对M1D、M3D广谱活性测定结果显示,M1D、M3D对乙型肝炎病毒三种主要的基因型A型、B型、C型都有较强的结合活性。第四,对人源化抗体M1D、M3D与抗原的相互作用进行研究。确定了抗体与抗原结合的关键CDR区和关键的氨基酸位点以及识别的抗原核心表位,M1D结合的核心表位为TGPCKTCT(aa1 18-125),M3D结合的核心表位为CKTCT(aa121-125)。综上,该研究对基于SA线性表位的治疗性疫苗在食蟹猴中诱导产生的抗体进行了初步探索。获得了两株食蟹猴来源的人源化抗体M1D、M3D,在HBV转基因鼠中具有显著清除HBsAg和DNA的能力。基于M1D、M3D识别表位的研究证明,二者均识别SA表位,且核心表位与E6F6识别表位部分重叠,进一步揭示SA线性表位特异性的抗体能够介导高效的HBV病毒清除,该研究结果也为基于该表位的治疗性疫苗的有效性评估提供了一定的指导意义,可为乙肝治疗性抗体药物的开发提供候选分子。此外,该研究建立的方法也可为性能优良的类人抗体开发提供新的手段。

关键词： NHP抗体记忆B细胞体外刺激培养乙肝表面抗原

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伪狂犬病毒衣壳及门户蛋白的冷冻电镜结构

伪狂犬病毒衣壳及门户蛋白的冷冻电镜结构

作者：查正恢厦门大学

学位级别：硕士

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于α疱疹病毒亚科,可引起猪的伪狂犬病(Pseudorabies,PR),具有传播范围广、死亡率高等特点,对养猪业造成巨大经济损失。PRV可交叉感染牛、羊、猫等各种动物,此外也出现少量人类感染的病例,被感染... 详细信息

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于α疱疹病毒亚科,可引起猪的伪狂犬病(Pseudorabies,PR),具有传播范围广、死亡率高等特点,对养猪业造成巨大经济损失。PRV可交叉感染牛、羊、猫等各种动物,此外也出现少量人类感染的病例,被感染的患者主要表现为眼内炎、脑炎等症状。虽然PR的兽用减毒活疫苗已经广泛投入使用,但PRV具有神经潜伏特性,一旦发生基因突变会被重新激活感染,容易造成新的疫情。PRV结构复杂,从外向内主要包括四个部分:富含糖蛋白的囊膜,皮层蛋白,二十面体核衣壳和内部的基因组。在PRV成熟过程中有三种类型衣壳:空心的A型衣壳(A-capsid)、内部含有支架蛋白的B型衣壳(B-capsid)以及装载基因组的C型衣壳(C-capsid)。PRV是研究疱疹病毒的模式病毒,同时在神经示踪及溶瘤病毒方面也有巨大应用潜力。深入研究PRV衣壳结构,对防治PR及改造利用病毒具有重大意义。本研究主要采用冷冻电镜技术结合结构生物学的分析手段,解析PRV A-capsid及C-capsid高分辨率结构,探究衣壳蛋白间相互作用机制。首先,本研究获得了高纯度的PRV病毒样品,冷冻电镜观察发现PRV样品中主要存在A-capsid和C-capsid两种颗粒形式。通过单颗粒三维重构技术,获得A-capsid和C-capsid的正二十面体对称结构,分辨率分别为4.53?和4.43?。电镜密度图显示,PRV的基因组在C-capsid内部呈现同心圆式的规则排列。PRV两种衣壳结构组成高度相似,但C-capsid表面在五倍轴区域覆盖有衣壳相关皮层蛋白复合物(capsid associated tegument complex,CATC)。由于PRV衣壳直径超过120nm,常规的单颗粒重构会出现局部欠焦值评估不准的现象,限制三维重构的分辨率。为改善这种问题,本研究采用局部重构的方法,将PRV两种衣壳的二、三、五倍轴局部区域信号分别进行提取并进行局部重构,成功将PRV两种衣壳结构的提高到近原子分辨率(<4?)。接着,基于高分辨率电镜结构,本研究搭建了 PRV两种衣壳的原子模型,并基于原子模型分析衣壳组装机制。PRV衣壳主要由955个主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)、900 个次要衣壳蛋白(Small capsid protein,SCP)及 960 个三聚体(Triplex)蛋白等亚基单元组成。MCP组装成五聚体(Penton)和六聚体(Hexon),并在内部发生广泛的相互作用。覆盖在Hexon顶部的SCP和嵌在Hexon与Penton之间的Triplex进一步稳固整个衣壳。同时本研究在Triplex的下方观察到疑似N端锚定结构,将基因组锚定在整个衣壳上。这些观察加强了本研究对PRV乃至疱疹病毒衣壳结构的认识。最后,本研究聚焦PRV衣壳特殊的门户(portal)顶点的结构解析。Portal只存在于PRV衣壳十二个五倍轴顶点中的其中一个顶点,portal内部结果为十二倍对称,与整体衣壳之间出现“对称失配”(symmetry mismatch)的现象,使用传统的二十面体重构方法会将portal结构的信号平均掉。本研究利用五倍轴亚颗粒对称性释放及三维分类等方法,成功分离出C-capsid的portal部分的亚颗粒,最终获得6.8A分辨率的portal结构,并基于portal的取向构建了含有portal的完整PRV C-capsid结构(6.9?)。结构显示portal顶点与普通五聚体顶点之间存在着巨大差异。Portal顶点包括下方十二倍对称portal和上方五倍对称的触手状螺旋(tentacle helices)。同时portal顶点结构保留的尾部DNA密度也证实了portal包装释放基因组的功能,提示portal结构在PRV衣壳组装中不可或缺的作用。综上,本研究通过冷冻电镜技术及局部重构方法,解析了高分辨率的PRV A-capsid和C-capsid的结构,从分子水平阐述了 PRV衣壳各亚基之间的相互作用机制,同时首次解析到PRV衣壳的portal结构。这些发现为更加全面地认识PRV,理解PRV衣壳组装机制,丰富疱疹病毒家族结构研究提供了重要参考。

关键词：伪狂犬病毒结构生物学冷冻电镜局部重构门户蛋白

人乳头瘤病毒39/68/70型交叉疫苗研究

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人乳头瘤病毒39/68/70型交叉疫苗研究

作者：杨与柔厦门大学

学位级别：硕士

持续感染高危型的人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)能引发黏膜组织上皮恶性病变,是引起女性宫颈癌的主要诱因。流行病学调查研究显示,宫颈癌已成为危害女性健康的第四大癌症。在中国乃至全球范围内,宫颈癌病例均呈现逐年上升态势... 详细信息

持续感染高危型的人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)能引发黏膜组织上皮恶性病变,是引起女性宫颈癌的主要诱因。流行病学调查研究显示,宫颈癌已成为危害女性健康的第四大癌症。在中国乃至全球范围内,宫颈癌病例均呈现逐年上升态势。HPV的结构蛋白包括主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2。L1蛋白可在体外表达并在一定的环境中组装成类病毒颗粒(virus like particles,VLPs),其表面保留了与天然HPV病毒颗粒相似的结构。目前已上市的HPV预防性疫苗均基于VLPs形式研发,其能诱导机体产生中和抗体,有效抵抗HPV感染。由于HPV疫苗具有严格的型特异性,其免疫后难以产生高滴度的型交叉中和抗体。目前,默克公司生产的HPV九价疫苗只能预防7种高危型HPV感染,保护率为90%。而HPV型别众多,能引发恶性肿瘤的至少有15种。为了预防更多型别HPV的感染,需要在现有疫苗基础上引入更多型别的VLPs,但是,这会导致疫苗生产成本激增、生产工艺更加复杂以及带来疫苗安全隐患等问题。因此,使用较少型别的VLPs预防更多型别的HPV感染(“一防多”)是下一代HPV预防性疫苗研究的方向。基于上述问题,本研究分析HPV L1蛋白亲缘关系,采用近缘间HPV L1表位移植策略构建嵌合型HPV L1 VLPs,对其进行全面的性质鉴定及免疫评价工作,筛选能诱导高滴度交叉中和抗体的候选疫苗分子,探索嵌合VLPs疫苗实现“一防多”的可行性。根据IARC(International Agency for Research on Cancer)致癌性分类,HPV39、HPV68、HPV70分别属于1类致癌物、2A类致癌物和2B类致癌物。流行病学统计表明,有3%的宫颈癌病例是由HPV39、HPV68和HPV70这三个型别的感染引起的。在我国,HPV39、HPV68的感染率为3-5%,HPV70的感染率为1%左右。因此,为了扩大疫苗保护范围,本研究以亲缘关系较近的HPV39、HPV68、HPV70三个高危型别为研究对象构建型交叉疫苗候选分子。首先,构建HPV39、HPV68和HPV70三个型别VLPs和假病毒,并对HPV39、HPV68和HPV70 VLPs进行理化性质和免疫原性检测,结果显示其VLPs形态规则,为T=7的二十面体结构;免疫原性分析结果显示三个型别VLPs均能诱导高滴度的中和抗体,具有良好的免疫原性。进一步,将HPV39、HPV68和HPV70中亲缘关系较近的HPV39和HPV68两型作为骨架构建HPV39/68和HPV68/39嵌合分子并表达纯化,利用SDS-PAGE、TEM、HPLC和AUC等方法进行理化性质检测并免疫小鼠,免疫血清中和检测显示两型嵌合蛋白中H39-68FG VLPs和H68-39BC VLPs诱导产生针对HPV39和HPV68的中和抗体滴度与野生型相当。再以H39-68FG VLPs和H68-39BC VLPs为骨架,构建HPV39/68/70三型嵌合蛋白,使用相同的方法进行理化性质分析并免疫小鼠,并结合ED5o检测方法筛选出H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HIVLPs两个能诱导高滴度三型交叉中和抗体的嵌合蛋白,其具有良好的热稳定性,可作为候选分子在后续疫苗研制中进一步评价。其次,利用HPV68 VLPs和HPV70 VLPs筛选的单克隆抗体对H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HI VLPs进行表位分析。将HPV68和HPV70的型特异单抗与H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HI VLPs进行ELISA检测,其中HPV68单抗9F4和HPV70单抗12B1 1与H39-68FG-70HI VLPs候选分子具有较高的结合活性,与野生型VLPs结果相当。这表明通过表面环区同源替换的方法能成功将HPV68和HPV70的表位移植至HPV39 L1 VLPs中,后续可进一步解析H39-68FG-70HI VLPs与9F4 Fab和12B11 Fab的免疫复合物结构,阐述其表位信息。综上,本研究通过HPV L1近缘表位替换构建了HPV39/68/70三型嵌合疫苗分子并在大肠杆菌中成功表达,其纯度高、颗粒形态规则且均一性好,利用小鼠免疫评价实验筛选出具有理想交叉保护效果的候选疫苗分子,实现了一种VLPs预防三种高危型别HPV的效果,为下一代HPV预防性疫苗研制奠定基础。

关键词：人乳头瘤病毒中和抗体型交叉疫苗

板浸润性对折流板脉冲萃取柱中液滴群体平衡行为的影响

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板浸润性对折流板脉冲萃取柱中液滴群体平衡行为的影响

作者：方琦清华大学

学位级别：硕士

折流板脉冲萃取柱(PDDC)是核化工行业中一种重要的液-液萃取设备,深入研究其中的液-液两相流对其性能预测、设计、运行等都有重要意义。群体平衡模型(PBM)是当前处理涉及到液滴群问题的液-液两相流的最有力工具之一,然而文献中已有的关... 详细信息

折流板脉冲萃取柱(PDDC)是核化工行业中一种重要的液-液萃取设备,深入研究其中的液-液两相流对其性能预测、设计、运行等都有重要意义。群体平衡模型(PBM)是当前处理涉及到液滴群问题的液-液两相流的最有力工具之一,然而文献中已有的关于PBM的研究,仍难以准确描述PDDC中的液滴行为。一方面,文献中已有的PBM子模型都是基于理论推导和从液滴尺寸分布逆推得到的,缺乏PBM子模型的直接实验数据;另一方面,还没有任何文献对板浸润性在液滴群体平衡行为中的作用进行过报道。因此,本论文以PDDC为研究对象,利用高速显微摄像技术,在考虑折流板浸润性的情况下进行液-液两相流中液滴群体行为规律的研究,并对PBM子模型进行直接测量。首先,在传统四源项PBM基础上,推导出了考虑浸润性影响的七源项PBM,并通过定义三个新的PBM子模型,给出了新的PBM源项的表达式。其次,以水-煤油为实验体系,研究了分别装有3种对分散相有不同浸润性的折流板的PDDC中的液滴群体平衡行为。通过实验,观察到了9种分散相拓扑结构变化模式,包括拉伸式破碎、迸发式破碎和扭曲式破碎3种液滴破碎方式,直接聚并到折流板表面、部分聚并到液层中并生成残留液滴和完全聚并到液层中3种液滴聚并方式,滴流型分散、射流型分散和拖曳型分散3种液滴分散方式。我们进一步研究了液滴的破碎、聚并和分散三种行为的规律并对其机理进行了详细分析。受板浸润性影响引起的液滴聚并和分散现象在本工作中首次得到报道。最后,以七源项PBM为基础,实验统计了液滴数密度分布数据和破碎频率函数、聚并频率函数、分散频率函数等PBM子模型,建立了PBM子模型的经验关联式,并采用群体平衡方程结合一个简化流动模型来计算PDDC中的液滴数密度分布函数,计算结果与实验结果符合良好,证明了实验得到的经验关联式的可靠性和所推导的七源项PBM在PDDC中的适用性。

关键词：折流板脉冲萃取柱浸润性破碎聚并群体平衡模型