检索结果-南通市图书馆

作者：向思柔西南大学

学位级别：硕士

木质素是植物体内重要的次生代谢产物,具有机械支持、保护和运输等重要生物学功能,同时也与植物的抗病性和抗倒伏等密切关联。目前,倒伏是影响油菜高质高产的重要因素之一,木质素对油菜倒伏指数直接贡献最大。因此,通过解析甘蓝型油菜... 详细信息

木质素是植物体内重要的次生代谢产物,具有机械支持、保护和运输等重要生物学功能,同时也与植物的抗病性和抗倒伏等密切关联。目前,倒伏是影响油菜高质高产的重要因素之一,木质素对油菜倒伏指数直接贡献最大。因此,通过解析甘蓝型油菜木质素生物合成调控机制对于油菜抗倒伏研究具有重要意义。我们前期研究中鉴定到一个参与调控甘蓝型油菜木质素生物合成代谢相关MYB转录因子BnMYB52a,本研究通过生物信息学分析、q RT-PCR分析、转基因表型分析、互作蛋白筛选和靶基因鉴定等研究技术手段,初步解析BnMYB52a参与调控木质素生物合成的分子机理。主要研究结果如下:(1)q RT-PCR分析结果表明BnMYB52a主要在茎杆和角果皮中高表达;亚细胞定位结果显示BnMYB52a定位于细胞核,说明BnMYB52a可能在细胞核中行使功能。(2)与野生型拟南芥相比,BnMYB52a基因超表达拟南芥株系(OEBnMYB52a)整体生长势弱,具体表现为叶片小、茎杆细、根部发育迟缓、分枝数少等特征;而突变体myb52表型与OE-BnMYB52a植株相反。此外,OEBnMYB52a和myb52株系抽薹比WT提前。q RT-PCR分析结果显示:与对照相比,OE-BnMYB52a中木质素生物合成相关的关键酶基因PAL、C4H、HCT、C3H、COMT、F5H、4CL、CCR和CAD的表达量均显著下调,说明BnMYB52a可能通过抑制拟南芥木质素生物代谢合成进而影响拟南芥植株正常的生长发育进程。(3)与OE-BnMYB52a拟南芥株系不同,OE-BnMYB52a甘蓝型油菜比对照植株生长势更强,表现为茎杆更粗壮、不易折断,田间抗倒伏能力明显增强,同时角果变短、果柄直径增加、生育期延迟等。解剖学观察分析发现:与对照相比,OE-BnMYB52a植株茎杆髓部薄壁细胞木质化更强,木质部维管束发育更完善、导管数量明显增多、维管束间隔距离变短;且角果皮木质化程度也强于对照,木质化薄壁细胞层数更多。木质素含量测定结果表明OE-BnMYB52a植株茎杆木质素总量和S型木质素百分含量与对照相比显著增加。通过q RT-PCR分析OEBnMYB52a植株中木质素通路的关键酶基因F5H、4CL、COMT、PAL、CCo AOMT、CCo AOMT1、C3H、C3’H、C4H、HCT和CCR表达特征发现,这些基因的表达量均显著上调。上述结果表明BnMYB52a可能通过促进油菜中木质素代谢通路关键基因的表达,来提高植株木质素总量和S型木质素的合成积累量,强化木质部,从而进一步提高甘蓝型油菜的抗倒伏能力。(4)利用DAP-Seq、酵母单杂交和双荧光素酶报告系统实验等技术手段,初步证明BnMYB52a能特异性的结合Bn4CL4、BnCCR1、BnMYB4、BnMYB43、BnMYB26、BnCYP81F1和BnIAA11的启动子,为进一步阐明BnMYB52a参与调控质素生物合成的分子机制奠定基础。(5)通过酵母双杂交和Bi FC实验,证明BnMYB52a与多个参与调控木质素合成的转录因子BnMYB54、BnMYB85、BnMYB43和BnMYB26存在明显的互作关系,说明甘蓝型油菜木质素合成调控网络复杂,其具体的作用机制有待进一步研究。综上结果,本研究初步证明甘蓝型油菜BnMYB52a是参与调控木质素生物合成的重要转录因子,并为解析其调控作用机制提供了新的证据,将为甘蓝型油菜抗性育种提供基因资源和思路。

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甘蓝型油菜谷胱甘肽转移酶基因BnGSTU12抗菌核病功能分析

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作者：李亚俐西南大学

学位级别：硕士

菌核病是油菜生产中的主要病害,可造成油菜产量降低和品质下降。谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-Transferases)是由一个大基因家族编码的多功能蛋白,它在生物体内具有响应胁迫,解毒抗逆,信号传导等重要功能。胁迫诱导的GST具有谷胱甘肽... 详细信息

菌核病是油菜生产中的主要病害,可造成油菜产量降低和品质下降。谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-Transferases)是由一个大基因家族编码的多功能蛋白,它在生物体内具有响应胁迫,解毒抗逆,信号传导等重要功能。胁迫诱导的GST具有谷胱甘肽过氧化物酶活性,可将有机氢过氧化物还原,防止植物遭受胁迫氧化损伤。目前,对于植物GST基因家族的研究主要集中在水稻、杨树、拟南芥对生物和非生物胁迫的抗性方面,关于GST基因在油菜菌核病抗性中的功能和作用机制方面的研究尚未见报道。前期我们对347份甘蓝型油菜进行离体茎秆接种鉴定,利用60K SNP芯片进行基因型分型,通过全基因组关联分析,检测到17个与茎秆抗性显著关联的SNP位点;另外,对抗性极端材料核盘菌接种48h后进行RNA-seq。结合全基因组关联分析和RNA-seq,我们发现一个谷胱甘肽-s-转移酶(GST)基因簇被诱导上调(BnaC06g31020D、BnaC06g31030D和BnaC06g31040D);同时核盘菌接种前后的差异表达基因富集到了谷胱甘肽代谢过程中。我们利用甘蓝型油菜全基因组重测序(5x)数据,进行GST候选基因关联分析,确定BnGSTU12(BnaC06g31030D)为抗病候选基因。本研究在前期研究基础上,通过qRT-PCR分析BnGSTU12基因在甘蓝型油菜不同部位和不同胁迫下的表达模式,并遗传转化拟南芥和甘蓝型油菜,结合酶活性分析,瞬时表达本氏烟草,对候选基因BnGSTU12在拟南芥和甘蓝型油菜菌核病抗性中的功能进一步研究;通过对转基因拟南芥和油菜接种核盘菌,测定接种前后的激素、抗氧化酶活性,解析BnGSTU12基因在抗病防御中的机理。本研究不仅对油菜抗菌核病的理论研究具有重要意义,还可以为油菜抗性育种提供新的策略。主要研究结果如下:(1)BnGSTU12在中双11中的组织表达模式结果表明,BnGSTU12在甘蓝型油菜的各个组织部位均有表达,在根、茎、叶片、雄蕊、角果皮和种子中表达量较高。对具有GUS活性的拟南芥进行染色分析发现Pro BnGSTU12在根、茎、叶片、花、角果上也均有染色,与qRT-PCR中的结果一致。对甘蓝型油菜进行核盘菌处理后,发现BnGSTU12基因的表达量在油菜叶片接种核盘菌24 h之后上升,表明核盘菌处理能诱导BnGSTU12表达。我们对干旱胁迫(PEG)、盐胁迫(Na Cl)和紫外光胁迫(UV)后BnGSTU12的基因表达进行分析,发现BnGSTU12基因的表达受非生物胁迫UV影响较大,而受PEG和Na Cl的影响较小;用不同的激素(ABA、GA3、KT、ETH、SA、Me JA)进行处理后,分析BnGSTU12的表达模式,发现BnGSTU12基因受ETH、SA、Me JA诱导表达。(2)对重组蛋白进行诱导表达并进行酶活性测定发现,在诱导的大肠杆菌中检测到约一条29 k Da的蛋白带,与预期的蛋白大小一致;BnGSTU12对CDNB有催化活性。(3)本研究构建了35S启动子植物过表达载体和VIGS沉默载体。利用植物过表达载体对拟南芥和油菜遗传转化后,观察其菌核病抗性。我们通过对离体叶片菌核病抗性鉴定,发现与野生型拟南芥相比,T代BnGSTU12过表达转基因拟南芥菌斑面积减小;活体拟南芥叶片接种核盘菌后,12 hpi、24 hpi、36 hpi转基因株系叶片的病变面积均比对照少。在甘蓝型油菜中,与WT相比,T代BnGSTU12过表达转基因油菜菌斑面积比ZS11菌斑面积减少。利用VIGS沉默载体对油菜遗传转化后,经过菌核病抗性鉴定发现,与转化了空载体的ZS11相比,T代转基因油菜菌斑面积增大。我们还利用植物过表达载体瞬时表达烟草,经过菌核病抗性鉴定和台盘蓝染色发现,与转化了空载体的烟草叶片相比,含pL-35S-Ds Red-BnGSTU12的烟草叶片的菌斑面积减少。以上结果表明,过表达BnGSTU12可以增强油菜对菌核病的抗性。(4)本研究对BnGSTU12过表达拟南芥和油菜进行核盘菌接种,并测定接种前后的SOD、POD、CAT、GST酶活性、HO、GSH和GSSG的含量。结果表明,过表达拟南芥中SOD、POD、CAT始终高于野生型植株,HO含量降低,且比WT更早出现下降趋势,在接种核盘菌12 h和24 h,过表达拟南芥中GST酶活性、GSH/GSSG高于WT;用DAB染色法检测拟南芥叶片中HO的积累情况,发现WT植株叶片出现大面积红色沉淀物,过表达拟南芥只有少量红色沉淀,表明BnGSTU12基因的过表达导致拟南芥抗氧化酶活性升高。过表达油菜中SOD、CAT始终高于野生型植株,POD活性在接种核盘菌24 h后均高于野生型植株,HO含量降低。随着接种时间的增加,BnGSTU12过表达油菜中GSH/GSSG和GST的活性均高于对

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转录因子Bna.A09MYB61调控甘蓝型油菜粒色的分子机理

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作者：徐雯西南大学

学位级别：硕士

甘蓝型黄籽油菜具有种皮薄,皮壳率低,多酚类物质和纤维素含量低,而含油量及饼粕蛋白质含量高等优点,因此,国内外育种家一直把培育黄籽油菜当成重要的研究目标之一。黄色籽粒的形成与类黄酮合成途径代谢产物的合成与积累密切相关,但目前... 详细信息

甘蓝型黄籽油菜具有种皮薄,皮壳率低,多酚类物质和纤维素含量低,而含油量及饼粕蛋白质含量高等优点,因此,国内外育种家一直把培育黄籽油菜当成重要的研究目标之一。黄色籽粒的形成与类黄酮合成途径代谢产物的合成与积累密切相关,但目前关于油菜粒色方面的研究报道,几乎全部基于拟南芥中类黄酮代谢网络的研究基础上,从遗传学的角度开展,尚未在油菜中发现新的控制种皮颜色的基因。因此,挖掘甘蓝型油菜种皮颜色基因并解析其调控机制,不仅具有重要的理论意义,还可为黄籽油菜育种提供新的策略。本研究前期通过对粒色主效基因进行精细定位,得到了候选基因Bna MYB61,经转基因验证该基因是一个可调控类黄酮途径代谢产物积累的转录因子,对甘蓝型油菜黄色籽粒形成具有重要作用,但其调控机制尚不明确。本研究以Bna.A09MYB61作为研究对象,在模式生物拟南芥中超量表达Bna.A09MYB61基因,对其转基因后代进行了类黄酮途径相关基因的表达模式比较、粒色性状分析以及调控机制解析,初步揭示了Bna.A09MYB61调控甘蓝型油菜粒色形成的分子机理。主要研究结果如下:（1）生物信息分析及亚细胞定位结果表明,Bna.A09MYB61是一个定位在细胞核上的R2R3型MYB转录因子。进化分析结果显示,Bna.A09MYB61与葡萄（Vitis vinifera L.）中原花青素合成相关的转录因子VvMYBPA1亲缘关系较近,且含有bHLH结合区域。推测在甘蓝型油菜中Bna.A09MYB61通过调控原花青素合成途径从而影响种皮颜色。（2）实验室前期研究发现Bna.A09MYB61可能参与调控类黄酮代谢合成途径,对Bna.A09MYB61在黄、黑籽材料中的表达量进行分析,结果表明,青荚前期Bna.A09MYB61在黑籽材料中的表达量明显高于黄籽材料,我们推测Bna.A09MYB61可能主要在种子发育早期发挥作用。为进一步探索该基因的时空表达模式,我们将Bna.A09MYB61的启动子（ProBna.A09MYB61:GUS）遗传转化至野生型拟南芥中并进行GUS染色,结果显示,在不同的生长时期及不同的组织器官中均检测到不同强度的GUS信号,表明Bna.A09MYB61的表达无特异性。此结果与甘蓝型油菜中的qRT-PCR结果一致。此外,我们还发现Pro Bna.A09MYB61:GUS除了在种子发育早期的GUS信号较强外,在植株整个生长期内的维管组织中均有较强的GUS信号,表明Bna.A09MYB61还可能参与维管组织生长发育过程。（3）对Bna.A09MYB61的异源超量表达拟南芥T3代植株与野生型以及突变体进行表型对比分析,发现苗期的Bna.A09MYB61超量表达植株与野生型相比叶片更大且抽苔时间提前,但突变体与野生型相比无较大差别,说明Bna.A09MYB61可能与植株的生长发育密切相关。种子成熟时,通过对Bna.A09MYB61的超量表达拟南芥种子和野生型种子进行二甲基乙酰胺二甲基缩醛（DMACA）以及香草醛染色实验,发现Bna.A09MYB61的超量表达拟南芥种子颜色均比野生型拟南芥籽粒颜色更深;进一步对种子中类黄酮途径次生代谢产物进行检测,结果显示,Bna.A09MYB61的超量表达拟南芥种子所含表儿茶素及原花青素的含量与野生型相比显著升高,表明Bna.A09MYB61在拟南芥中可调控原花青素的合成从而影响种皮颜色。（4）我们对野生型和超量表达拟南芥植株中类黄酮次生代谢途径基因的表达量进行分析,发现类黄酮合成途径上游基因TT4（TRANSPARENT TESTA 4）、TT5（TRANSPARENT TESTA 5）、TT6（TRANSPARENT TESTA 6）、TT8（TRANSPARENT TESTA 8）与下游基因TT18（TRANSPARENT TESTA 18）、TT19（TRANSPARENT TESTA 19）、BAN（BANYULS）基因在超量表达植株中的表达量与对照相比显著上调。通过酵母单杂交点对点以及双荧光素酶系统（LUC）实验验证,发现Bna.A09MYB61通过绑定Bna.A10TT4、Bna.C09TT4、Bna.C08TT6、Bna.C08TT5的启动子从而影响原花青素合成,进而促进甘蓝型油菜粒色的形成。（5）实验室前期筛选到可能调控甘蓝型油菜粒色的转录因子bHLH92,通过酵母双杂交以及Bi FC实验,发现Bna.A09MYB61与BnabHLH92相互作用,进一步通过对Bna.A06bHLH92、Bna.A07bHLH92与下游靶基因的酵母单杂交点对点实验,发现Bna.A06bHLH92、Bna.A07bHLH92转录因子可以调控Bna.A10TT4、Bna.C09TT4、Bna.C08TT6、Bna.C08TT5的表达。因而推测Bna

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甘蓝型油菜BnGLK1a调控叶绿体发育影响光合速率及千粒重的机理研究

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作者：张乾微西南大学

学位级别：硕士

甘蓝型油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一,提高菜籽产量是油菜重要的育种目标。对于大多数作物而言,提高光合效率是大田环境下增加作物产量的一种有效措施,而叶绿体是植物进行光合作用的主要场所,叶绿体的合成和发育直接影响植物... 详细信息

甘蓝型油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一,提高菜籽产量是油菜重要的育种目标。对于大多数作物而言,提高光合效率是大田环境下增加作物产量的一种有效措施,而叶绿体是植物进行光合作用的主要场所,叶绿体的合成和发育直接影响植物的光合效率、有机物同化、生物量积累及产量形成,但其发育调控机制极为复杂,在甘蓝型油菜中有关叶绿体发育调控的分子机制研究较少。前期本实验室通过对甘蓝型油菜叶片叶绿素含量进行QTL定位分析,在A07染色体候选区间内注释到一个MYB类转录因子BnGLK1a（Bna A07g00410D）,并初步确认该基因参与调控甘蓝型油菜叶绿体的发育。在此基础上,本研究通过转基因互补验证、表型鉴定、qRT-PCR分析、互作蛋白筛选和Bi FC等技术进一步证明转录因子BnGLK1a直接参与调控甘蓝型油菜叶绿体发育及叶绿素积累,同时影响甘蓝型油菜的光合效率,进而影响菜籽产量。同时围绕BnGLK1a参与叶绿体发育调控的分子机制进行了进一步解析。主要研究结果如下:（1）在BnGLK1a基因超量表达和RNAi转基因油菜纯合株系中,经qRT-PCR分析发现,与对照相比,BnGLK1a在超表达株系OE-BnGLK1a-213/-214和干扰株系RNAi-BnGLK1a-207/-209中表达水平变化显著,进而用于后续研究。通过对转基因株系表型观察发现,与对照相比,超表达株系OE-BnGLK1a-213/-214植株叶片呈明显深绿色,而干扰株系RNAi-BnGLK1a-207/-209植株叶片呈浅绿色。同时总叶绿素平均含量在超表达株系中比对照增加17%,而在干扰株系中比对照降低12%。这一结果说明BnGLK1a影响甘蓝型油菜叶片中叶绿素积累水平从而直接影响叶片颜色。（2）通过对叶片中叶绿体超微结构进行细胞学观察分析发现:与对照相比,超表达BnGLK1a植株叶片中叶绿体基粒明显增厚,而干扰BnGLK1a植株叶片中叶绿体基粒变薄;同时对叶绿体中类囊体膜层数计数结果显示:类囊体膜层数在对照材料中平均值为8.6,超表达材料中为18.2,而干扰株系中为4.2;同时,超表达BnGLK1a植株叶片中单个细胞内叶绿体积累个数也明显多于对照。本研究结果说明BnGLK1a直接影响甘蓝型油菜叶片类囊体膜的积累水平,引起基粒厚度的变化,从而调控叶绿体的发育;同时还能增加叶绿体数量,为叶片的高光效奠定了基础。（3）利用LI-6800光合测定仪对光合作用相关参数进行测定分析发现:与对照相比,光合效率正相关参数CO2同化的量子效率（Phi CO2）、光照条件下的最大PSII量子产率（Fv'/Fm'）、电子传输速率（ETR）和光照下PSII的光化学产率（Phi PS2）等在超表达BnGLK1a株系中均显著增大,在干扰BnGLK1a株系中均显著减小,然而非光化学淬灭系数（NPQ）则呈相反趋势,所测参数变化趋势均符合预期。同时相关性分析表明上述参数均与净光合速率呈线性相关关系,且相对于对照材料,超表达BnGLK1a株系植株净光合速率显著增大,反之干扰BnGLK1a株系植株净光合速率显著减小,说明BnGLK1a能直接影响甘蓝型油菜光合速率。（4）利用qRT-PCR对叶绿素合成途径中关键基因（BnGUN4和BnCAO）的表达特性进行分析发现,与对照相比,基因BnGUN4和BnCAO在超表达BnGLK1a株系中表达量显著上升,而在干扰BnGLK1a株系中表达量显著下降,同时光系统Ⅱ中捕光复合体重要亚基BnLHCB6也呈现相同的表达模式,说明BnGLK1a可通过调控相关基因的表达参与调控叶绿素合成,为解析BnGLK1a调控叶绿素合成、叶绿体发育的机制提供了基因表达层面的证据。（5）利用Y2H和Bi FC实验初步确定BnGLK1a分别与BnPYL1-2和BnCSN5A存在互作关系,且在拟南芥中超表达BnCSN5A后叶片相较于野生型呈深绿色。脱落酸处理后,对照材料叶片发生轻微黄化,超表达BnGLK1a株系无显著变化,而干扰BnGLK1a株系叶片黄化严重甚至受到损伤;同时在ABA处理后,相关基因（BnGLK1a、BnPYL1-2、BnCSN5A以及BnWRKY40）的qRT-PCR分析结果表明,BnGLK1a通过分别与BnPYL1-2、BnCSN5A互作参与调控甘蓝型油菜脱落酸信号响应,且在响应过程中起负调控作用。（6）千粒重统计分析结果表明:与对照材料（千粒重平均值为3.68g±0.19）相比,超表达BnGLK1a株系（千粒重平均值为4.075g±0.14）千粒重提高约10%,而干扰BnGLK1a株系（千粒重平均值为3.06g±0.05）千粒重下降16%。相关性分析结果显示千粒重与BnGLK1a表达水平呈正相关关系,在OE-BnGLK1a-213和OE-BnGLK1a-214中BnGLK1a的表

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***56调控甘蓝型油菜种皮色素合成的功能研究

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作者：王慧艺西南大学

学位级别：硕士

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国主要的油料作物,是食用油的重要来源。菜籽油的品质与油菜籽粒颜色密切相关,相对于黑籽油菜,黄籽油菜具有蛋白质含量高、种皮薄、油质清澈的特点,黄籽油菜是主要的育种目标。黄色籽粒的形成是由于... 详细信息

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国主要的油料作物,是食用油的重要来源。菜籽油的品质与油菜籽粒颜色密切相关,相对于黑籽油菜,黄籽油菜具有蛋白质含量高、种皮薄、油质清澈的特点,黄籽油菜是主要的育种目标。黄色籽粒的形成是由于种皮内皮层类黄酮物质原花青素合成受阻,种皮缺少色素而呈现种胚的颜色即黄色。甘蓝型油菜在自然种质中无黄籽资源,且遗传背景复杂,得到稳定遗传的甘蓝型黄籽油菜十分困难。目前甘蓝型油菜关于粒色的研究,大部分是以拟南芥类黄酮途径为基础,在油菜中找到其同源基因并进行验证。但甘蓝型油菜是异源四倍体,存在大量同源基因,与拟南芥相比,粒色调控机制更为复杂。前期已经通过QTL定位与全基因组关联分析找到一些重要QTL位点与相关候选基因,但候选基因功能并未进行验证,油菜粒色调控网络仍然需要完善。因此,挖掘调控油菜粒色的关键基因,解析甘蓝型油菜粒色的分子调控机制对育成高品质油菜具有重要意义。本研究通过对甘蓝型油菜中双11不同发育时期的种皮进行转录组共表达分析,发现了一个hub基因***56,可能参与苯丙烷合成途径、花青素与原花青素合成途径,目前***56在甘蓝型油菜中是否参与类黄酮途径物质合成还未见报道。本研究围绕***56在甘蓝型油菜种皮色素合成中的生物学功能进行初步探究,主要结果如下:(1)通过对中双11不同时期组织器官转录组数据和定量PCR结果进行分析,甘蓝型油菜中MYB56的六个同源基因,***56与***56两个基因在花后20-30天的种皮中高水平表达,且***56基因表达水平最高,此外在花、根中仅有少量表达。将***56基因启动子与带有GUS标签的表达载体融合并转化野生型拟南芥,对纯合转基因拟南芥进行GUS染色,在早期的种子、苗期的根、毛状体和花序中检测到较强GUS信号,与定量结果基本一致。亚细胞定位结果表明***56定位于细胞核中,转录活性分析显示***56具有较高的转录抑制活性。(2)我们构建***56超表达载体转化野生型拟南芥,观察其表型。与野生型拟南芥相比,突变体拟南芥未发现显著表型差异,但超表达拟南芥种子颜色偏黄,种皮色素积累减少;利用香草醛进行种子染色,发现超表达种子染色更浅;进一步利用UPLC-HESI-MS/MS对超表达种子进行次生代谢物分析,结果发现表儿茶素与原花青素的三种复合体含量显著减少。此外,超表达植株整体长势较弱,叶片小且卷曲,根系短,侧根发育异常,表明***56能影响拟南芥生长发育。(3)通过遗传转化和组织培养获得***56超表达油菜,表型分析发现超表达油菜花后25天的种子经过香草醛染色后,比对照的染色更浅。进一步对其进行UPLC-HESI-MS/MS检测,所检测到的差异代谢物主要包括类黄酮类物质,其中表儿茶素与原花青素的五种复合体均显著减少,此外以山奈酚与芥子酸为标量的相关物质含量同样减少,而以槲皮素为标量的物质含量增加,但并不显著,结果表明***56影响油菜种子类黄酮物质和原花青素合成。(4)构建***56及其同源基因的敲除载体,通过遗传转化与组织培养获得了25棵植株,经靶点序列检测得到一株敲除成功的油菜以待后续研究。(5)我们对对照和超表达油菜种子进行转录组测序,KEGG分析结果表明,差异表达基因主要富集在苯丙烷合成途径、淀粉蔗糖代谢途径和类黄酮合成途径。我们筛选出***56下游调控的候选靶基因BAN2、CHIL2、4CL、LDOX、FLS2与DFR1,启动子分析结果显示,这些基因均具有MYB结合位点。q RT-PCR表明,相较于对照,所有候选靶基因在超表达油菜中的表达水平均显著下调。我们对对照和超表达拟南芥类黄酮途径关键基因的表达水平进行q RT-PCR检测,发现At PAL、At C4H、At4CL、At CHI、At BAN、At LDOX、At DFR、At TTG1和At TT8均下调表达,表明***56通过负调控类黄酮途径相关基因表达减少原花青素及其衍生物的合成。通过Y2H和Bi FC实验发现***56与类黄酮调节因子BnaMYB61、根系发育蛋白BnaMYB77、木质素相关蛋白BnaMYB54以及功能未知蛋白Bnab HLH96相互作用。综上所述,***56能负调控类黄酮途径关键基因的转录水平,从而减少类黄酮和原花青素等物质的含量使种皮色素积累减少。***56在甘蓝型油菜粒色形成中具有重要意义,其分子作用机制还需继续探究。

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甘蓝型油菜粒色相关代谢物的全基因组关联分析及候选基因筛选鉴定

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作者：唐云山西南大学

学位级别：硕士

甘蓝型油菜是我国重要的油料作物之一,与黑籽油菜相比,黄籽油菜具有种皮薄、含油量与蛋白含量高、色素类及抗营养类物质含量低等优点,具有较高的营养品质与商业价值。然而,甘蓝型油菜中并不存在天然的黄籽资源,人工选育的甘蓝型黄籽油... 详细信息

甘蓝型油菜是我国重要的油料作物之一,与黑籽油菜相比,黄籽油菜具有种皮薄、含油量与蛋白含量高、色素类及抗营养类物质含量低等优点,具有较高的营养品质与商业价值。然而,甘蓝型油菜中并不存在天然的黄籽资源,人工选育的甘蓝型黄籽油菜性状遗传不稳定,易受环境、母本及修饰基因的影响,因此甘蓝型油菜黄籽性状调控机理极其复杂。在甘蓝型油菜中,粒色形成与类黄酮、多酚等次生代谢产物紧密相关。目前,基于代谢组学的全基因组关联分析已广泛用于代谢物的生物功能分析及功能基因组学。因此,利用差异代谢物进行全基因组关联分析将有助于揭示其形成的生化过程,阐明甘蓝型油菜粒色差异形成的分子机理。本研究以黄黑籽差异明显的187份高世代自交系甘蓝型油菜为材料,利用UPLC-HESI-MS/MS对花后35天种子进行广泛靶向代谢物检测分析,结合课题组自建种子代谢数据库及公共代谢数据库,首先比较分析确定黄黑籽甘蓝型油菜种子中稳定的差异代谢组分;其次,以差异代谢物为考察性状,基于甘蓝型油菜60K芯片获得的基因型信息进行mGWAS分析,确定候选区间;再利用基因组和转录组数据对候选区间进行基因注释并筛选候选基因;最后构建候选基因相关表达载体遗传转化拟南芥初步验证其生物学功能。本研究结果为利用基因工程进行油菜遗传改良和新种质资源创制奠定了良好基础。主要研究结果如下:(1)黄黑籽甘蓝型油菜差异代谢物鉴定利用UPLC-HESI-MS/MS对不同环境中187份自交系材料花后35天种子进行广泛靶向代谢组分析,在筛选的6对极端黄黑籽材料中共检测到710个高质量离子峰,基于课题组自建油菜种子代谢库及公共代谢数据库比较确定了37种黄黑籽间差异代谢物,包括11种类黄酮类:m105(3’4’57-tetrahydroxyflavanone)、m106(epicatechin)、m108((+)-33'4'57-pentahydroxyflavan)、m197([DP2]-2)、m198([DP2]-1)、m233([DP3]-2)、m235([DP3]-1)、m249([DP4])、m128(isorhamnetin)、m193(is-3-O-glucoside-sulfate)和m118(quercetin);1种酚酸类m55(4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde)以及25种未知类代谢物。(2)差异代谢物与关联性状相关分析计算获得三个环境中代谢物的BLUP值,采用BLUP值对未知差异代谢物与已知代谢物之间、差异代谢物与性状之间分别进行相关分析,结合Pearson相关系数和显著性检验结果发现17种未知差异代谢物与已知类黄酮类呈极显著正相关,经二级质谱比对分析确认11种未知差异代谢物在结构上与表儿茶素及衍生物密切相关;通过差异代谢物与粒色相关分析共存在27种差异代谢物与黄籽度呈极显著负相关关系,同时还与种子部分储存物质具有一定显著相关性。(3)差异代谢物的mGWAS分析本研究以不同环境下27种粒色差异代谢物成分及综合的BLUP值为考察性状进行了全基因组关联分析,结果共检测到609个显著关联SNP位点,单个SNP的贡献率在9.5%～61.23%之间,其中142个显著关联SNP位点在不同环境、不同代谢物之间被重复检测到,分布在Chr A02、Chr A04、Chr A06、Chr A09、Chr C03、Chr C04和Chr C08染色体上。通过连锁不平衡及单体型分析鉴定出259个候选区间,覆盖基因组大小约为51.16 Mb。重要的是,q TNA09-21区间位点贡献率普遍在20%以上且与大部分差异代谢物显著关联,因此我们认为该区间是重要候选区间。(4)差异代谢物候选基因筛选以课题组组装的高质量黄黑籽甘蓝型油菜(GH06和ZY821)基因组为参考,首先将候选区间mapping到参考基因组上,然后根据基因注释信息和黄黑籽转录组分析结果,在候选区间内初步筛选到116个候选基因,包括47个转录因子(MYB类转录因子、b HLH类转录因子和WRKY类转录因子等)、56个结构基因(泛素化相关基因、漆酶基因、转运蛋白及相关代谢途径基因等)和13个未知功能基因。(5)候选基因功能分析本研究将全基因组关联分析所获得的部分候选基因构建了超表达载体并遗传转化了拟南芥,目前初步发现候选基因BnaA09MYB58转基因株系与野生型相比,抽薹延迟、种子颜色明显加深、籽粒皱缩等,说明候选基因BnaA09MYB58除参与色素代谢合成外还参与其它生长发育进程。

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转录因子BnbHLH92a调控甘蓝型油菜粒色变化的分子机理研究

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作者：胡冉西南大学

学位级别：硕士

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界上重要的油料作物之一,其黄籽性状与种子油脂和蛋白质含量的增加、饼粕的饲料价值的提高相关联。种子作为油菜的主要收获器官,其种皮中富含的色素与多酚类物质不仅使种皮表现出不同颜色(如黑色、黄... 详细信息

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界上重要的油料作物之一,其黄籽性状与种子油脂和蛋白质含量的增加、饼粕的饲料价值的提高相关联。种子作为油菜的主要收获器官,其种皮中富含的色素与多酚类物质不仅使种皮表现出不同颜色(如黑色、黄色、红色、红褐色和黑褐色等),还会严重影响菜籽油品质及饼粕饲用价值。因此,育种家们希望通过选育黄籽油菜的策略来降低其种皮色素含量进而改善油菜品质,提高其商品价值。类黄酮作为广泛存在的次级代谢产物,在植物生长过程中尤其是颜色的变化过程发挥至关重要作用。尽管在芸薹属油菜中围绕类黄酮代谢途径下游结构基因(DFR、LDOX和ANS)、MYB和b HLH家族及它们形成的MBW复合体被证明广泛参与植物中苯丙烷-类黄酮代谢途径多种初生和次生代谢过程,并在最终决定组织器官颜色形成中发挥重要作用,但由于甘蓝型油菜基因组相对比较复杂,同一基因存在多个拷贝,其在甘蓝型油菜粒色形成中的分子机制尚不清楚。本研究在解析粒色重要调控基因Bn MYB47功能机理的基础上,鉴定到一个影响花青素/原花色素积累的负向调控因子BnbHLH92a(Bn SCA06)与其存在互作关系,超表达BnbHLH92a基因后拟南芥种子变为黄色,我们推测BnbHLH92a参与调控甘蓝型油菜粒色变化。因此,本文重点围绕BnbHLH92a参与调控粒色的分子机理开展研究,主要研究结果如下:(1)通过对BnbHLH92a在甘蓝型油菜不同组织器官表达模式和黄黑籽不同发育时期种子表达量分析发现,BnbHLH92a主要在黄籽中高表达;利用生物信息学对BnbHLH92a分析发现,它具有典型的螺旋-环-螺旋b HLH保守结构域,与已报道的参与类黄酮代谢的转录因子Lcb HLH92进化关系较近。亚细胞定位和转录活性分析表明Bnb HLH9a是一个定位于细胞核且具有较强抑制活性的转录因子。因此,我们推测BnbHLH92a影响种皮色泽差异形成的负向调控因子。(2)超表达BnbHLH92a基因拟南芥种皮呈黄色,经组织化学染色与化学方法测定发现其花青素/原花色素(PAs)含量显著降低;通过UPLC-HESI-MS/MS进一步分析转基因拟南芥株系中多酚和类黄酮的种类与含量,发现原花色素类衍生物是主要的差异代谢物;同时利用q RT-PCR分析发现类黄酮生物合成途径关键基因(TT3、TT6、TT8、TTG1、TT18和BAN)转录水平在超表达株系中显著下调。综上研究结果表明BnbHLH92a通过抑制花青素/原花色素(PAs)的积累从而导致拟南芥种皮颜色变浅。(3)通过对超表达BnbHLH92a基因油菜株系的UPLC-HESI-MS/MS分析结果表明:与对照相比,差异代谢物主要富集在花青素/原花色素生物合成途径。通过Y2H和Bi FC进一步证明BnbHLH92a与Bn TTG1存在互作关系,它们可能形成复合体进而参与调控花青素/原花青素代谢。同时,利用酵母单杂交、染色质免疫沉淀定量和荧光素酶报告基因实验证明Bn TT18是BnbHLH92a下游靶基因位点,即BnbHLH92a可通过直接结合Bn TT18的启动子序列来抑制其表达,从而参与类黄酮代谢,但具体的作用靶位点需进一步鉴定。综上所述,BnbHLH92a是一个调控类黄酮代谢途径的反式抑制因子,一方面BnbHLH92a可能与Bn MYB47和Bn TTG1形成竞争性MBW复合体,干扰MBW复合体对类黄酮途径结构基因的正常调控;另一方面BnbHLH92a可直接靶向调控结构基因Bn TT18,阻遏类黄酮代谢产物的积累,进而影响甘蓝型油菜种皮颜色的变化,但具体的作用机制有待于进一步深入研究。

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白菜型油菜转录因子BrMYB111参与粒色形成作用机理研究

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作者：姜海燕西南大学

学位级别：硕士

研究认为相同遗传背景的黄籽油菜与黑籽油菜相比,其性状更加优良,不仅种皮薄、皮壳率低,初榨油中色素含量少,含油量和蛋白含量增加,而且在加工中不需要进行脱色处理,保持了初榨油的风味,显著降低加工成本。因此,在油菜育种中,黄籽油菜... 详细信息

研究认为相同遗传背景的黄籽油菜与黑籽油菜相比,其性状更加优良,不仅种皮薄、皮壳率低,初榨油中色素含量少,含油量和蛋白含量增加,而且在加工中不需要进行脱色处理,保持了初榨油的风味,显著降低加工成本。因此,在油菜育种中,黄籽油菜选育被认为是油菜的主要育种目标之一。相比于其它芸薹属作物,白菜型油菜中存在天然的黄籽资源,同时也是其它芸薹属作物中黄籽基因的重要供体亲本。因此通过挖掘白菜型油菜中黄籽基因资源并解析其功能,将有助于阐明甘蓝型油菜粒色差异形成的分子机理,对于芸薹属作物品质遗传改良具有重要理论和实践意义。实验室前期利用基因组、代谢组、转录组等多组学结合分析技术筛选到一个与白菜型油菜中类黄酮代谢物合成密切相关的转录因子BrMYB111。因此,本研究围绕BrMYB111基因的生物学功能与其参与调控类黄酮途径的分子机制进行了初步探索。具体研究结果如下:(1)本研究从白菜型油菜中成功克隆了BrMYB111基因的两个成员,命名为BrMYB111-A6和BrMYB111-A9,其全长CDS序列长度分别为1032 bp和1044 bp,分别编码344和348个氨基酸,为典型R2R3-MYB转录因子。序列比对结果显示,白菜型油菜和甘蓝型油菜的A6、A9染色体上的MYB111基因序列完全一致。序列特征和进化分析结果表明:BrMYB111与拟南芥At MYB111序列同源,且属于同一亚类,亲缘关系较近,可能具有类似的生物学功能。(2)利用qRT-PCR技术对BrMYB111基因在白菜型油菜中的组织表达特异性进行分析,结果显示,BrMYB111-A6在花蕾中表达量最高,而BrMYB111-A9在种子中表达量最高,说明BrMYB111基因不同成员在白菜型油菜不同组织部位行使功能。(3)亚细胞定位分析结果表明:BrMYB111两个成员均定位在细胞核上,具有转录因子的特性。(4)本研究首先通过构建BrMYB111两个基因成员的超表达载体瞬时转化烟草,结果显示,BrMYB111过量表达能诱导类黄酮类物质二氢槲皮素的积累,说明BrMYB111两个成员作为激活子参与调控二氢槲皮素生物合成。其次,分别构建BrMYB111两个基因成员RNAi沉默表达载体,同时将超表达和RNAi表达载体遗传转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。在BrMYB111基因超表达转基因株系中,BrMYB111-A6基因能正向调控类黄酮合成基因TRANSPARENT TESTA 3(TT3)、TRANSPARENT TESTA 4(TT4)、TRANSPARENT TESTA 5(TT5)、TRANSPARENT TESTA 6(TT6)、TRANSPARENT TESTA 7(TT7)、Flavonol Synthase 1(FLS1)和TRANSPARENT TESTA 18(TT18)表达,而BrMYB111-A9基因可以反向调控这些类黄酮代谢途径关键基因的表达;同时互补转化拟南芥myb111突变体发现,myb111-OEBrMYB111A9转基因植株种子颜色变浅,而myb111-OEBrMYB111A6变化不显著,说明白菜型油菜中BrMYB111两成员对于粒色形成的调控方面存在功能分化,BrMYB111-A9是参与粒色调控的主要成员。(5)本研究利用酵母点对点和Bi FC实验证明,BrMYB111-A6和BrMYB111-A9均与Br TTG1、BrMYB47、Brb HLH92、Br CSN5A和Br CYTC等基因存在互作关系;通过DAP-seq筛选到BrMYB111-A9的4个下游靶基因:Br ATPA、Br NDHK、Br ATPB、Br BBX18。为进一步解析其调控作用机制奠定基础。综上所述,BrMYB111不仅直接参与调控类黄酮代谢途径的某些关键基因,还与其它调控因子协同调控类黄酮代谢途径,可能在影响白菜型油菜和甘蓝型油菜的粒色差异形成过程中发挥重要作用。

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不同类型白菜形态分化基因筛选及功能解析

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作者：马一方西南大学

学位级别：硕士

芸薹属(Brassica)植物在世界上被广泛用作饲料、调味料、油料和蔬菜作物等,主要包括三个二倍体种(白菜、黑芥和甘蓝)和三个异源四倍体种(甘蓝型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥)。同时芸薹属植物具有高度多样化的形态类型,如叶球、膨大... 详细信息

芸薹属(Brassica)植物在世界上被广泛用作饲料、调味料、油料和蔬菜作物等,主要包括三个二倍体种(白菜、黑芥和甘蓝)和三个异源四倍体种(甘蓝型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥)。同时芸薹属植物具有高度多样化的形态类型,如叶球、膨大器官(根、茎和花序)和广泛腋生分枝等。其中,白菜具有比其他芸薹属植物更丰富的形态特征,包含结球型(大白菜)、根膨大型(芜菁)和油用型(白菜型油菜)等不同的可塑性形态类型。因此,基于白菜种内极高的形态多样性,通过挖掘更多与重要农艺性状相关的基因,揭示白菜生长、发育模式以及分化产生多样性器官的分子机理,将有助于白菜类作物与其它芸薹属作物的遗传改良。本研究基于白菜泛基因组和131份不同类型白菜(46份结球类、32份芜菁类和53份油用类白菜)的重测序数据,通过全基因组选择消除分析,筛选到多个在白菜驯化过程中受选择的重要基因,其功能与白菜形态类型多样化相关联,并对其生物学功能进行了初步验证。具体研究结果如下:1.不同类型白菜资源材料变异分析本研究完成对53份油用型白菜型油菜(YC型)简化基因组测序,结合已发表的46份结球型大白菜(CC型)和32份根膨大型芜菁(LB型)的重测序数据,构成一个131份不同类型白菜资源的分析群体,重测序数据总大小为667.84 Gb,平均测序深度约为14.44×。通过对重测序数据进行比对和变异检测分析,在该群体中分别检测到2.39M的SNPs和0.28M的In Dels,并将131份白菜群体划分为3个基本类群,结果表明YC型和LB型之间遗传距离较近,CC型和YC型、LB型之间遗传距离较远。2.不同类型白菜形态多样性基因的筛选通过全基因组选择信号分析,本研究在三种形态类型的白菜中共检测到2364个信号位点,其中CC型1188个、YC型544个和LB型632个,说明CC型在进化中被驯化程度最高。通过对这些候选基因相关联的SNPs和In Dels分析和功能进行注释发现,在受选择的候选基因中初步获得7个可能与白菜结球形态相关的基因Br CLASP(Bra A07g000700.3C)、Br P2C56(Bra A01g016800.3C)、Br NPR2(Bra A01g16870.3C)、Br TCP17(Bra A03g003300.3C)、Br YAB1(Bra A03g023630.3C)、Br ARF4(Bra A10g018230.3C)和Br SAUR36(Bra A03g023650.3C);2个可能与根膨大形态相关的基因Br MYC2(Bra A05g023030.3C)和Br PYL1(Bra A09g022320.3C)。3.不同类型白菜形态分化相关候选基因克隆本研究分别以三种不同类型的5个材料(1个CC型大白菜CC2、1个YC型白菜型油菜YC2、3个LB型芜菁LB2与甘蓝型油菜20K132和20K204)对9个候选基因进行了克隆比对分析,结果显示3个基因(Br TCP17、Br ARF4和Br NPR2)在CC型与其它类型的基因序列之间存在一致性突变,其中Br TCP17基因在CC2和LB2中发现两个稳定的有义突变,Br ARF4和Br NPR2基因在CC2和LB2中各发现一个稳定的有义突变,这些突变均导致对应的氨基酸序列发生变异,作为重要候选基因用于验证分析。4.不同类型白菜形态分化相关候选基因功能初步验证本研究分别从CC型和LB型材料中分别扩增获得3个基因(Br TCP17、Br ARF4和Br NPR2)的CDS序列,通过构建相应的超表达载体(LB2-TCP17、CC2-ARF4、LB2-ARF4和CC2-NPR2)转化拟南芥和CRISPR-Cas9基因编辑载体(Bn CLASP)转化甘蓝型油菜对其进行了基本的生物学功能分析,具体结果如下:(1)与野生型拟南芥相比,过表达LB2-TCP17拟南芥株系植株的叶卷直立、花育性降低;同时促进主根生长,侧根数量增加,说明Br TCP17可调控叶片形态和根的生长发育进程。(2)与野生型拟南芥相比,过表达LB2-ARF4和CC2-ARF4拟南芥株系侧根数量明显增多,且LB2-ARF4的作用更显著;同时莲座基叶数量增加,抽薹开花明显提前,说明Br ARF4具有调控植株生长发育、叶片形态和根生长发育的生物学功能。(3)与野生型拟南芥相比,过表达CC2-NPR2拟南芥株系叶片变小、莲座基叶数量明显增多,说明Br NPR2主要对叶片形态和生长发育有调控作用。(4)与对照相比,在敲除甘蓝型油菜(中双11)Bn CLASP同源基因后,其主根变粗,侧根数量和长度减少;另外,出现花瓣增生、育性降低和植株矮化等形态特征,初步说明Bn CLASP基因在促进植株的生长发育方面具有显著作用,其具体的分子机理有待于进一步研究。

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甘蓝型油菜油酸和亚麻酸的遗传分析及油酸与部分农艺和品质性状的通径分析

甘蓝型油菜油酸和亚麻酸的遗传分析及油酸与部分农艺和品质性状的...

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作者：周银珠西南大学

学位级别：硕士

油酸,即十八碳-9-烯酸,是最为重要的单不饱和脂肪酸。高油酸(>75%)特性的菜籽油在食用油和工业上有很高的应用价值。目前,在低芥酸的基础上进一步提高油酸含量、降低亚麻酸含量已成为油菜育种的一个重要目标。但是,在低芥酸背景下油菜... 详细信息

油酸,即十八碳-9-烯酸,是最为重要的单不饱和脂肪酸。高油酸(>75%)特性的菜籽油在食用油和工业上有很高的应用价值。目前,在低芥酸的基础上进一步提高油酸含量、降低亚麻酸含量已成为油菜育种的一个重要目标。但是,在低芥酸背景下油菜种子油酸、亚麻酸的遗传规律以及高油酸性状对农艺产量性状的影响还缺乏系统研究。为此,本文开展了如下两个方面的研究： 1、本研究利用气相色谱仪测定双低甘蓝型油菜高油酸品系Y520与中油酸品系08T15组合的P1、P2、F1、B1、B2、F2六个世代单粒种子油酸、亚麻酸含量,并应用植物数量性状遗传体系主基因+多基因混合遗传模型的多世代联合分离分析法对种子油酸、亚麻酸的遗传进行分析。结果表明：1)E模型(两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型)为Y520x08T15组合油酸的最优遗传模型;控制油酸含量的2对主基因效应主要为加性效应和上位性效应;2对主基因的加性效应值近似相等;2对主基因的低油酸含量对高油酸含量均有部分显性;2对主基因所控制的油酸含量是不相等的,第2对主基因所控制的油酸含量明显高于第1对主基因;油酸的遗传率较高。2)D模型(一对加性－显性主基因+加性－显性-上位性多基因模型)为Y520×08T15组合亚麻酸的最优遗传模型;该主基因以加性效应为主;多基因遗传率明显大于主基因遗传率。 2、有研究表明高油酸性状会伴随着一些不利的农艺学性状,且油菜种子的油酸含量与种子产量呈负相关等等。为了进一步弄清油菜种子油酸含量与种子农艺性状、品质性状之间的关系,以指导高油酸、低亚麻酸油菜的育种,进行本研究。以208个油酸含量>65%的甘蓝型中高油酸六世代单株材料为样本,进行株高、有效分枝数、含油量、亚油酸、亚麻酸等8个农艺、品质性状与高油酸性状的相关、通径分析。结果表明：株高、有效分枝数、分枝起点、每果平均粒数直接或间接地对高油酸性状有轻微的负向接作用,千粒重、含油量对高油酸性状有较小的正向作用,但这六个因素的作用都很小,即高油酸性状对油菜主要农艺产量性状没有明显的不利影响!亚油酸是影响高油酸性状最重要的因素,通径系数为-0.8444;亚麻酸是影响高油酸性状的另一重要因素,通径系数为-0.4483。

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