检索结果-南通市图书馆

作者：李昕琦安徽农业大学

学位级别：硕士

家蚕抗菌肽Cecropin B是家蚕免疫系统产生的一种具有生物活性的小分子多肽,无分子内的二硫键,分子质量约为4kDa,其N端和C端分别具有强碱性和强疏水性。抗菌肽Cecropin B具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用,此外抗菌肽还可作为绿色健康的... 详细信息

家蚕抗菌肽Cecropin B是家蚕免疫系统产生的一种具有生物活性的小分子多肽,无分子内的二硫键,分子质量约为4kDa,其N端和C端分别具有强碱性和强疏水性。抗菌肽Cecropin B具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用,此外抗菌肽还可作为绿色健康的饲料添加剂应用在畜牧生产中,促进动物健康生长,提高动物自身免疫力,因此抗菌肽的研究已成为生命科学领域的一大热点。抗菌肽从生物组织中分离获得大量的抗菌肽难度大,成本高,以融合蛋白的形式表达,表达产物活性较低,纯化过程比较复杂,并且翻译后加工修饰不完善,而采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统所产生的重组病毒多数情况下通过皮下注射的方式接种昆虫,效率低下,因此通过构建可同时表达polh基因和外源目的基因的真核表达系统进行抗菌肽基因工程的研究已成为一个热门话题。本研究应用Bac-to-Bac表达系统,构建含有家蚕抗菌肽cecropin B2基因与polh基因的双启动子载体,在家蚕中表达,获得具有抑菌活性的Cecropin B抗菌肽,并进行表达量分析,研究结果如下：1.获得重组杆状病毒BmNPV-CecB2/polh分别以质粒PET-32a-BmCecB2和野生型T3株基因组DNA为模板进行PCR扩增,合成BmCecB2基因和polh基因,再将两个基因克隆到pFastBacDual转移载体Pp10和Pph的MCS的下游,构建重组质粒pFastBacDual-CecB2/polh,再转化到DH10Bac ***感受态细胞,发生转座,获得重组Bacmid-CecB2/polh, Bacmid DNA通过转染BmN细胞获得重组杆状病毒BmNPV-CecB2/polh。2.目的基因在家蚕幼虫中表达及鉴定重组Bacmid-CecB2/polh通过脂质体介导转染BmN细胞,转染72h后,BmN细胞有明显的感染症状,在显微镜下可见细胞呈现圆球形,并能观察到大量的多角体。重组病毒液经口添食家蚕幼虫,144h后,添食重组病毒的家蚕有明显感染症状,蚕血呈乳白色,收集受感染家蚕的血液,超声裂解细胞,Tricine-SDS-PAGE结果表明家蚕抗菌肽cecropin B基因与polh基因在家蚕体中均得到表达,家蚕抗菌肽cecropin B基因大小约为4.9KD,polh基因大小约为29KD。抑菌试验的结果显示表达的家蚕抗菌肽Cecropin B具有抑菌活性,抑菌直径为10mm。ELISA表达量检测结果得知蚕体粗提物中BmCecB2平均浓度0.115μ/mL,蚕血BmCecB2平均浓度为0.109μg/mL,为今后进一步的实验研究提供依据。通过以上研究结果表明,构建双启动子表达载体同时表达家蚕抗菌肽cecropin B基因及polh基因,由此获得的重组病毒既可以在家蚕培养细胞内表达,也可以利用多角体经口添食感染家蚕幼虫实现高效率表达,为大规模生产及畜牧业应用提供理论基础。

关键词：抗菌肽Cecropin B 多角体蛋白 pFastBacDual Bac-to-Bac表达系统抗菌活性

家蚕胚胎发育过程中RNA m6A甲基化及相关修饰酶的作用研究

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家蚕胚胎发育过程中RNA m6A甲基化及相关修饰酶的作用研究

作者：胡佩安徽农业大学

学位级别：硕士

RNA m6A（RNA N6-methyladenine,RNA m6A）是发生在RNA腺嘌呤（A）第六位氮原子（N）上的转录后修饰。作为一种由甲基化酶和去甲基化酶以及识别蛋白所共同催化的动态可逆的修饰方式,其在基因表达的调控、动物的生长发育、和人类各种疾... 详细信息

RNA m6A（RNA N6-methyladenine,RNA m6A）是发生在RNA腺嘌呤（A）第六位氮原子（N）上的转录后修饰。作为一种由甲基化酶和去甲基化酶以及识别蛋白所共同催化的动态可逆的修饰方式,其在基因表达的调控、动物的生长发育、和人类各种疾病等各方面发挥着重要作用。已有研究表明家蚕胚胎发育整个时期存在RNA m6A修饰且与家蚕基因表达调控相关联。因此,研究家蚕P50品系的胚胎发育和RNA m6A修饰之间的关系,期望能够对家蚕RNA m6A的研究做出一定程度上的补充。本研究以家蚕P50品系为材料,在个体水平通过LC-MS/MS技术对该品系胚胎发育过程中RNA m6A修饰水平进行测定,比较滞育前后RNA m6A含量变化,通过RT-q PCR技术检测相关酶的相对表达水平;在细胞水平通过RNAi技术对甲基化酶进行干扰,检测细胞周期的变化情况,主要结果如下:*** m6A甲基化酶生物信息学分析。通过对家蚕RNA m6A甲基化酶METTL3、METTL14的结构域分析同源性比对和进化树分析发现,家蚕（Bombyx mori）与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）以及哺乳动物人类（***）都存在一个相同的结构域。此外,家蚕METTL3和METTL14与其同属于鳞翅目的昆虫棉铃虫的亲缘关系最为接近。这些结果表明,RNA m6A甲基化酶在进化过程中是非常保守的。2.家蚕胚胎发育时期RNA m6A含量分析。通过LC-MS/MS质谱测定发现,RNA m6A存在家蚕胚胎全部发育过程,但整体RNA m6A修饰水平较低;另外,通过比较盐酸处理前后（产后2d-5d）RNA m6A水平发现,解除滞育后胚胎的RNA m6A水平显著高于滞育蚕卵。*** m6A甲基化酶和去甲基化酶相对表达量分析。首先,甲基化酶METTL3、METTL14和去甲基化酶ALKBH5在未浸酸胚胎中均有一定程度的表达;其次,在浸酸处理之后,四种酶的相对表达量较浸酸前总体表达趋势都有显著性升高。*** m6A甲基化酶和去甲基化酶的组织表达。METTL3、METTL14和FTO、ALKBH5广泛的分布在家蚕的各个组织中。METTL3、METTL14和ALKBH5均在精巢和卵巢中表达量较高,其他组织中表达量较低。5.家蚕Bm N细胞中甲基化酶的干扰和细胞周期的检测。干涉METTL3、METTL14后,G1期细胞数量均显著降低;对于METTL3而言,细胞的细胞周期滞留在S期,无法正常通过该时期并进入G2/M期。METTL14中G2/M期细胞数也明显降低,细胞增殖受到影响。综上所述,本研究从家蚕胚胎中检测出RNA m6A甲基化修饰,并发现未浸酸卵RNA m6A水平较低,浸酸卵RNA m6A水平有显著的升高;在不同胚胎发育过程RNA m6A甲基化酶和去甲基化酶的表达水平在浸酸后也有所升高,以及METTL3、METTL14和ALKBH5基因在精巢和卵巢中表达量较高;在细胞水平构建甲基化酶METTL3和METTL14干扰表达体系,干涉后细胞周期的G1期细胞数下降,S期细胞数显著升高,细胞无法正常的进入G2/M期,细胞的增殖受到影响。这些研究结果将为全面揭示家蚕滞育机理,理解家蚕的胚胎发育与RNA m6A甲基化修饰的相互关系提供了新的线索。

关键词：家蚕胚胎发育滞育 m6A 甲基化酶去甲基化酶

家蚕BmβGRP4应答BmNPV侵染及先天性免疫功能研究

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家蚕BmβGRP4应答BmNPV侵染及先天性免疫功能研究

作者：马艳安徽农业大学

学位级别：硕士

在养蚕业中,传染性蚕病危害最为严重的一种病毒病是家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV）病,Bm NPV侵染家蚕以及家蚕抗Bm NPV感染的分子机制一直是研究的热点和重点,但其入侵的分子机制至今还未完全阐明。基... 详细信息

在养蚕业中,传染性蚕病危害最为严重的一种病毒病是家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV）病,Bm NPV侵染家蚕以及家蚕抗Bm NPV感染的分子机制一直是研究的热点和重点,但其入侵的分子机制至今还未完全阐明。基于iTRAQ数据结果,获得了差异表达的模式识别受体蛋白β-1,3-glucan recognition protein 4 precursor（BmβGRP4）,本研究分别在转录水平和蛋白水平分析该蛋白在不同品系感染Bm NPV前后的差异表达,探究其在抗Bm NPV以及家蚕先天性免疫途径方面的相关功能。研究获得结果如下:***βGRP4的鉴定及应答NPV感染差异表达的验证基于iTRAQ数据分析,获得了在不同抗性品系感染Bm NPV前后差异表达蛋白BmβGRP4,对该基因进行生物信息学分析,并以RT-q PCR对iTRAQ结果进行验证,结果与iTRAQ基本相符,Western blot结果表明感染Bm NPV后,BmβGRP4蛋白的表达水平在感性品系P50中上调,而在抗性品系BC9中呈相反的趋势。***βGRP4的转录水平和蛋白水平的表达模式分析RT-qPCR结果显示,BmβGRP4基因在中肠和马氏管中具有较高的表达水平。Western blot结果显示,BmβGRP4蛋白在中肠和血液中具有较高的表达水平。免疫荧光技术研究BmβGRP4在感性品系P50中肠和脂肪体组织分布情况,结果表明BmβGRP4蛋白在中肠和脂肪体组织中都有分布。***βGRP4蛋白的瞬时封闭对病毒基因复制的影响BmβGRP4蛋白的瞬时封闭结果表明BmβGRP4蛋白具有抑制病毒复制的作用,可能具有抗病毒的功能。***βGRP4蛋白对家蚕先天性免疫途径的功能分析BmβGRP4蛋白能够抑制家蚕血淋巴pro PO的激活,但是对PO活性没有影响;可以抑制细菌诱导Toll和IMD免疫途径,而对细菌诱导JAK/STAT免疫途径无影响。

关键词： iTRAQ 家蚕 BmβGRP4 家蚕核型多角体病毒应答免疫

家蚕几丁质脱乙酰酶CDA8的鉴定及响应BmNPV侵染的功能分析

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家蚕几丁质脱乙酰酶CDA8的鉴定及响应BmNPV侵染的功能分析

作者：尤玲玲安徽农业大学

学位级别：硕士

家蚕(Bomyx mori)是一种重要的经济昆虫,也是研究鳞翅目昆虫的理想模式生物。家蚕核型多角体病毒(*** nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)病是蚕业生产上危害最为严重的一类蚕病,严重制约了蚕业生产的发展。家蚕围食膜(Peritrophic memb... 详细信息

家蚕(Bomyx mori)是一种重要的经济昆虫,也是研究鳞翅目昆虫的理想模式生物。家蚕核型多角体病毒(*** nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)病是蚕业生产上危害最为严重的一类蚕病,严重制约了蚕业生产的发展。家蚕围食膜(Peritrophic membrane,PM)是外源性物质通过消化道进入家蚕体内的第一道屏障,几丁质是围食膜的重要组成部分。几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是一类催化几丁质脱乙酰反应的酶,在昆虫生长发育过程中具有调节昆虫蜕皮、组织生长和抗病免疫等重要作用。目前,家蚕几丁质脱乙酰酶应答病原体入侵的研究尚未有报道。因此,研究家蚕几丁质脱乙酰酶与BmNPV之间的关系,有助于进一步补充家蚕对BmNPV抗性机制的研究。本研究前期通过分析两品系感染BmNPV组与对照组的家蚕消化液Label-free定量蛋白质组学数据,成功筛选到一个可能参与家蚕应答BmNPV侵染的候选蛋白,即家蚕几丁质脱乙酰酶8(BmCDA8),然后以家蚕BmNPV感性品系P50和抗性品系A35为研究材料,进一步探索BmCDA8响应BmNPV侵染的作用机理,主要结果如下:***8生物信息学分析首先对BmCDA8的cDNA核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析,明确BmCDA8的信号肽和ORF阅读框的位置。同源性分析表明,BmCDA8与鳞翅目(烟草天蛾、棉铃虫等)的几丁质脱乙酰酶具有较高的同源性。***8的时空表达模式分析采用RT-qPCR和半定量RT-PCR分析BmCDA8的表达水平。组织表达分析表明,BmCDA8在家蚕前肠和中肠中表达量较高,除了在头部有少量表达外,在其他组织中均不表达,BmCDA8是家蚕肠道特异表达的基因。发育时序分析表明,BmCDA8只在家蚕幼虫期表达,在卵、蛹以及蛾期均不表达,且BmCDA8的表达水平随着龄期的增长显著升高。此外,该基因在4龄幼虫蜕皮后高表达,在眠前和眠中表达均较低。推测BmCDA8可能与家蚕幼虫期围食膜的更新有关。***8重组蛋白的原核表达、抗体制备及蛋白活性分析采用原核表达系统成功诱导表达并获得BmCDA8第49-331个氨基酸,其蛋白分子量约为35kDa,并继续对该蛋白进行纯化,用纯化后的蛋白成功制备了抗血清。纯化后的重组BmCDA8蛋白,通过体外复性得到可溶性蛋白。进一步通过酶活测定,酶活力为1.21±0.14U,证明重组BmCDA8具备良好的脱乙酰酶活力。然后对重组BmCDA8进行几丁质结合功能测定,以BSA作为参照,证明重组BmCDA8具有结合几丁质的能力。4.不同抗性家蚕品系中BmCDA8响应BmNPV感染的模式分析不管是转录水平还是蛋白水平,感性品系P50和抗性品系A35在感染BmNPV后的12h至48h中肠中BmCDA8的表达水平均显著增加。而在72h P50中BmCDA8显著下调表达,A35依然上调表达。推测在BmNPV感染过程中,抗性品系A35通过持续的上调表达BmCDA8,使围食膜的结构更完整,从而更好地抵御BmNPV的侵染。进一步利用Western blot对中肠、围食膜组织和消化液进行分析发现,不管是感性品系和抗性品系BmCDA8的表达水平在感染病毒后均上调,且抗性品系A35的上调更加显著。5.研究BmCDA8及CDA抑制剂对BmNPV复制的影响家蚕P50品系添食重组BmCDA8蛋白后,能显著降低BmNPV对家蚕个体的侵染力。猜测重组BmCDA8能够结合到家蚕围食膜上,增强了几丁质的修饰作用,从而使家蚕围食膜在抵御BmNPV侵染中更加完整,能够更好的阻止BmNPV的侵染。相反,家蚕P50品系添食CDA抑制剂(5-羟基-L-色氨酸)后,能增强病毒对家蚕个体的侵染力。综上所述,本研究基于Label-free蛋白质组学技术筛选出应答BmNPV的差异蛋白BmCDA8。研究证明了该蛋白在家蚕前肠和中肠特异表达的蛋白,具有几丁质结合和脱乙酰功能,在抗性品系中表达量较高,且添毒后持续上调表达,具有应答BmNPV的现象。重组BmCDA8活性蛋白能降低BmNPV对家蚕个体的侵染力,5-羟基-L-色氨酸可以增强BmNPV对家蚕个体的侵染。结果表明BmCDA8可能具有抗病毒功能,本研究结果为进一步解析家蚕抗性品系应答BmNPV侵染的机理提供了理论支撑。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒围食膜几丁质几丁质脱乙酰酶8

基于亚细胞蛋白水平鉴定与BmNPV互作的家蚕中肠蛋白

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基于亚细胞蛋白水平鉴定与BmNPV互作的家蚕中肠蛋白

作者：于东安徽农业大学

学位级别：硕士

家蚕是一种重要经济吐丝昆虫,也是研究昆虫分子生物学以及免疫学的模式生物,在蚕丝产业和昆虫科研领域都有极其重要的作用。家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕饲养的过程中主要病原微生物之一,由其引起的家蚕核型多角体病毒病对蚕丝产... 详细信息

家蚕是一种重要经济吐丝昆虫,也是研究昆虫分子生物学以及免疫学的模式生物,在蚕丝产业和昆虫科研领域都有极其重要的作用。家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕饲养的过程中主要病原微生物之一,由其引起的家蚕核型多角体病毒病对蚕丝产业的危害极大,传染性极强,难以控制,每年都会给养蚕业带来严重损失,严重阻碍了蚕丝产业的发展。本研究把亚细胞蛋白质组学的研究作为切入点,以家蚕中肠亚细胞蛋白组分分离技术为基础,结合SDS-PAGE、2-DE、Far-western blot技术,在体外鉴定与Bm NPV相互作用的中肠亚细胞组分蛋白,期望对Bm NPV的侵染机制作出一定程度上的补充。研究结果如下:1.本研究成功分离家蚕中肠亚细胞组分,提高了蛋白鉴定的分辨率。2.本研究以Far-western blot的方法在家蚕中肠线粒体、微粒体亚细胞组分中一共鉴定了24个能在体外与Bm NPV结合的蛋白。3.对筛选的候选蛋白在不同家蚕品系中进行RT-q PCR验证,结果表明:除了trypsin之外,其余23个基因在抗性品系A35添毒24 h后,表达水平均下调;感性品系P50添毒24 h后,H+-ATPaseβ1、H+-ATPase d、AK2、ECH1、ECH2、ETFalpha、SSR-beta、Acads、RACK-1等基因呈现出上调趋势,HIBADH、H+-ATPaseβ2、SDRs、YWHA等基因变化趋势不明显,V-ATPase A、V-ATPase B、actin-4、ATP synthase、e EF1 gamma、AST、SP、LIPH、VDAC2、β-tubulin等呈现出下调趋势。其中H+-ATPaseβ1、H+-ATPase d、AK2、ECH1、ECH2等能量相关基因在两个品系中呈现出相反的趋势,推测这几个基因可能与品系之间抗性差异有关。4.根据对候选互作蛋白的功能分析结果,从候选互作蛋白中选择膜融合相关蛋白进行验证,相关蛋白分别是V-ATPase-A,V-ATPase-B和actin-4。原核表达出以上三个蛋白,然后利用原核表达的蛋白进行Far-western blot病毒孵育实验验证,结果证实这三个蛋白确实能在体外与Bm NPV互作。综合以上研究结果,从全新的角度对家蚕的病毒入侵的机制做了一定程度的补充,为后续进一步研究病毒与宿主互作以及Bm NPV致病机理研究提供有价值的信息。

关键词：家蚕核型多角体病毒 Far Western Blot 相互作用 RT-PCR

家蚕核型多角体病毒泰国株的鉴定及其bro基因家族分析

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家蚕核型多角体病毒泰国株的鉴定及其bro基因家族分析

作者：周敬波安徽农业大学

学位级别：硕士

BmNPV为环状双链DNA病毒，属杆状病毒科，核型多角体病毒属，主要感染家蚕，严重影响蚕茧的质量与产量，给养蚕生产带来了巨大的经济损失。bro基因家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷贝，且在... 详细信息

BmNPV为环状双链DNA病毒，属杆状病毒科，核型多角体病毒属，主要感染家蚕，严重影响蚕茧的质量与产量，给养蚕生产带来了巨大的经济损失。bro基因家族是一类在昆虫杆状病毒科中出现的多基因家族，在不同的病毒株中有不同的拷贝，且在碱基序列上也有明显不同。近年来，研究发现，bro基因在病毒侵染宿主的过程中具有一定的功能。通过比较NCBI数据库中现有BmNPV不同株系的序列得知，不同地区的BmNPV基因组序列存在一定差异，并且bro基因家族所在的区域存在较大的差异。BmNPV T3株基因组中存在bro-a、bro-b、bro-c、bro-d、bro-e5个拷贝，分布于基因组的三个区域。本研究以BmNPV泰国株为研究材料，对其进行了鉴定分析，并对其bro基因家族进行了测序比对分析，对bro基因的功能和进化进行了初步探讨。 1. BmNPV泰国株的分离纯化及鉴定分析本实验室与泰国Mahasarakham大学合作从泰国家蚕品种（Nanglai）中分离纯化得到一种家蚕NPV病毒，暂定名为BmNPV-Thai。通过对BmNPV泰国株的几个保守基因（p10、p35、polh、egt、vp39）进行了克隆测序与比对分析，鉴定该病毒为一种新的BmNPV病毒株。 2. bro基因的同源性分析以BmNPV泰国株的基因组为模板，PCR扩增出了bro-a，bro-c，bro-d三个基因片段。在BmNPV中，bro基因主要分布在基因组的三个区域，以T3基因组的bro基因分布为标准，CQ1株在第二个区域缺失bro-b基因，GD株在第三个区域缺失bro-e基因，泰国株在第二和第三个区域中同时缺失了bro-b、bro-e基因，而bro-d基因在几株病毒中都存在。与NCBI数据库中BmNPV bro基因序列进行比对分析，结果表明BmNPV泰国株bro基因存在较多的插入及缺失，不同株系对应bro基因之间同源性较高，差异主要集中在其氨基酸序列的N端部分。泰国株BRO蛋白的N端序列符合Zemskov等分析发现的与DNA连接相关的保守序列模式，经ANTHEPRO5.O软件预测泰国株BRO蛋白均无跨膜区和信号肽。 3. bro基因的系统发育分析从邻接法（Neighbor-Joining）构建的bro基因系统发育树中可以看出，泰国株的3个bro基因分别存在于2个亚组中，泰国株bro-d与T3、CQ1、GD株bro-d以及SC7株bro-III属于A亚组，泰国株bro-a，bro-c与T3、CQ1、GD株bro-a，bro-c以及SC7株bro-II属于B亚组，但是泰国株在C亚组中没有出现对应的bro基因。bro-a和bro-c组成的B亚组与bro-d所在的A亚组进化关系较近，而后再与bro-b和bro-e组成的C亚组相聚，bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在不同株系基因组中的位置分布特征，进一步支持了Kang等的观点：bro-d是BmNPV生存所必需的，bro-a和bro-c相互间功能互补。就现在的研究结果而言，bro基因家族在BmNPV中的最简约形式还不能确定，还有待进一步的探索研究。通过保守基因及bro基因家族的序列分析，鉴定了一个新的病毒株，分析了该病毒株bro基因的系统进化。通过不同地域的病毒株的系统进化分析，为进一步研究NPV病毒对家蚕的感染机制作出了贡献。

关键词： BmNPV 鉴定分析 bro基因系统发育地理分布

家蚕BmARM-like基因的克隆、表达与亚细胞定位研究

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家蚕BmARM-like基因的克隆、表达与亚细胞定位研究

作者：尤征英安徽农业大学

学位级别：硕士

本项目的前期研究工作通过荧光差异显示技术，比较分析了家蚕(Bombyx mori)对BmNPV不同抗性品系基因表达的差异，获得了一个差异表达的片段。本研究通过在家蚕数据库中的比对，获得了该片段所在基因的完整ORF框，分析该基因为一新基因... 详细信息

本项目的前期研究工作通过荧光差异显示技术，比较分析了家蚕(Bombyx mori)对BmNPV不同抗性品系基因表达的差异，获得了一个差异表达的片段。本研究通过在家蚕数据库中的比对，获得了该片段所在基因的完整ORF框，分析该基因为一新基因，在家蚕中未有研究报道，定名为BmARM-like基因，GenBank登录号为：JF500112，对该基因进行克隆、测序、序列分析、原核表达，并对该基因进行了时空表达及亚细胞定位研究，结果如下： 1.运用数据库分析BmARM-like基因的功能域，该基因含有一个Armadillo/beta-catenin-like repeat (ARM)结构和两个HEAT结构，根据有关文献报道ARM有可能参与Wnt信号途径的转导。根据BmARM-like基因的完整ORF的序列设计特异引物，通过RT-PCR方法扩增获得该基因编码框序列，其ORF为1923bp，编码640个氨基酸，其氨基酸序列与蜜蜂、果蝇、人和家鼠相似氨基酸同源性分别为32.50,24.53,22.27和19.11%。 2.将BmARM-like基因片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)上，转化到BL21（DE3）感受态菌在大肠杆菌中，诱导表达，并对表达的重组蛋白纯化，制备了该重组蛋白的兔多克隆抗体。 3.运用Real-time PCR的方法分析了家蚕BmARM-like基因在P50和A35五龄三天幼虫的中肠、脂肪体、血液、精巢、卵巢和头六个组织的表达以及P50的不同发育阶段新产下三天的卵、幼虫、蛹和蛾的表达情况，结果表明：家蚕BmARM-like基因在P50和A35两品种中的同一组织表达量是有差异的，并且在同一品种的不同组织中家蚕BmARM-like基因的表达量也是有差异的;不同的发育阶段，卵的表达量较低，幼虫时表达量达到最大值，随后经过蛹、蛾又逐渐降低;而通过抗性水平检测实验表明A35对BmNPV的抗性高于P50，推测该基因表达产物有可能通过家蚕的血液组织抑制病毒的不同形式有关。 4.为了研究BmARM-like基因产物在病毒感染环境下细胞中的定位，将BmARM-like片段与EGFP报告基因融合，用杆状病毒表达系统构建了重组病毒：通过病毒感染观察，发现荧光信号主要定位于家蚕细胞的细胞核内，但细胞质和细胞膜上也有微弱的荧光信号。通过以上研究结果表明， BmARM-like基因在mRNA水平上主要在家蚕的中肠及血液组织中高表达，这与家蚕抗病毒的免疫组织主要是中肠和血液相一致;BmARM-like基因的表达产物主要定位在细胞核中，有可能参与一些重要的信号途径的转导相关。因此，本文的研究为进一步揭示BmARM-like基因产物的具体功能奠定了基础。

关键词：家蚕 BmARM-like基因表达分析 Real-time PCR Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统亚细胞定位

抗菌肽Thanatin与Polh的原核融合表达及其真核表达研究

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抗菌肽Thanatin与Polh的原核融合表达及其真核表达研究

作者：王成林安徽农业大学

学位级别：硕士

抗菌肽Thanatin是一个含有21个氨基酸残基的线性多肽，首次被发现存在于昆虫椿（Podisus maculiventris）中，与蛙（frog）皮肤抗菌肽brevinin家族有很高的序列同源性。其有一个位于C末端的二硫键桥环，属于阳离子抗菌肽，既抗真菌，又... 详细信息

抗菌肽Thanatin是一个含有21个氨基酸残基的线性多肽，首次被发现存在于昆虫椿（Podisus maculiventris）中，与蛙（frog）皮肤抗菌肽brevinin家族有很高的序列同源性。其有一个位于C末端的二硫键桥环，属于阳离子抗菌肽，既抗真菌，又抗细菌，表现出极广的抗菌谱，具有广阔的应用价值。由于在组织内含量微少，所以很难从组织中获得大量的抗菌肽。通过化学合成的方法获得抗菌肽成本高，因此利用基因工程的方法生产抗菌肽成为近年来研究的热点。本研究首次构建了含家蚕核型多角体蛋白Polh与Thanatin融合基因的原核表达载体，进行原核表达，纯化后用盐酸羟胺切割后初步纯化获得具有抗菌活性的Thanatin蛋白;研究首次以昆虫杆状病毒体系中表达了椿（Podisus maculiventris）抗菌肽Thanatin。获得以下主要结果：1．根据大肠杆菌基因密码子偏爱性，对Thanatin进行基因优化，并用overlapextension PCR的方法扩增，得到Thanatin基因与家蚕核型多角体病毒多角体蛋白Polyhedrin基因融合基因，将融合基因克隆到表达载体pET28a（+）中，构建了表达载体pET-28a-Polyhedrin-Thanatin，转化*** BL21(DE3)，IPTG诱导表达。大肠杆菌表达产物经过SDS-PAGE电泳和Western blot检测，诱导表达的菌体中有与融合蛋白理论值（35kD）相符的目的条带，凝胶扫描分析目的融合蛋白以包涵体的形式表达，且诱导后6h融合蛋白的表达量最大，约占菌体总蛋白量的30%，表明Polyhedrin-Thanatin融合基因在*** BL21(DE3)宿主菌中获得成功表达。融合蛋白纯化后用盐酸羟胺切割后初步纯化，经过抑菌试验结果表明，表达的Thanatin蛋白具有一定的抑细菌活性。2．采取Bac–to-Bac表达系统将抗菌肽Thanatin基因在昆虫细胞中表达，将抗菌肽Thanatin基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBacI，构建的重组质粒pFastBacI-Thanatin转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，发生体内重组，获得杆粒Bacmid-Thanatin。杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染家蚕细胞（BmN)，获得含Thanatin基因的重组杆状病毒，重组病毒感染Bm细胞后，表达目的蛋白。超声裂解细胞，抑菌试验结果显示，表达的Thanatin蛋白具有抑制大肠杆菌菌活性。为今后进一步的分离纯化Thanatin等实验研究提供依据。

关键词：抗菌肽Thanatin 家蚕核型多角体蛋白原核表达抑菌活性杆状病毒表达系统

家蚕丝氨酸蛋白酶Bmcoll和Bmclsp的鉴定及应答BmNPV表达分析

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家蚕丝氨酸蛋白酶Bmcoll和Bmclsp的鉴定及应答BmNPV表达分析

作者：许新安徽农业大学

学位级别：硕士

丝氨酸蛋白酶(serine protease,SPs)是昆虫体内普遍存在的一类水解酶。它们在蛋白消化、生长发育、信号转导等方面发挥重要作用。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引发的血液型脓病对养蚕业造成了严重的危害... 详细信息

丝氨酸蛋白酶(serine protease,SPs)是昆虫体内普遍存在的一类水解酶。它们在蛋白消化、生长发育、信号转导等方面发挥重要作用。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引发的血液型脓病对养蚕业造成了严重的危害。BmNPV侵染家蚕以及家蚕抗BmNPV感染的分子机制一直是研究的热点和重点,但其入侵的分子机制至今还未完全阐明。基于本实验室前期不同抗性品系家蚕中肠消化液定量蛋白质组学Label-free数据结果,我们成功筛选到两个差异表达的候选蛋白家蚕丝氨酸蛋白酶collagenase(Bmcoll)和chymotrypsin-like serine protease(Bmclsp)蛋白,本研究以家蚕中肠组织为材料克隆丝氨酸蛋白酶Bmcoll和Bmclsp并对其进行了序列结构特征和表达特性分析,在此基础上,分析了Bmcoll和Bmclsp在不同品系应答BmNPV感染前后的转录水平和蛋白水平的差异表达。本研究具体结果如下:1.候选蛋白Bmcoll和Bmclsp的筛选及转录水平的验证。基于Label-Free数据分析,获得了在不同抗性品系感染BmNPV前后差异表达蛋白Bmcoll和Bmclsp,并以RT-q PCR及Western Blot对其结果进行验证,结果显示Bmcoll的表达与Label-Free一致,而Bmclsp的表达与Label-Free基本相符。***和Bmclsp生物信息学分析。生物信息学分析发现,家蚕丝氨酸蛋白酶Bmcoll和Bmclsp蛋白均存在信号肽序列,能够指导蛋白向胞外分泌。同时,Bmcoll和Bmclsp该两种蛋白均具有丝氨酸蛋白酶结构域(Trypsin-like serine protease),在该结构域中具有其特有的三联体催化中心His(H)-Asp(D)-Ser(S)。对Bmcoll和Bmclsp基因序列分析可为后续的研究明确方向。***和Bmclsp时空表达分析。对Bmcoll和Bmclsp进行时空表达分析,结果表明:Bmcoll和Bmclsp基因在家蚕幼虫第五龄期高表达,在卵、蛹、成虫期低表达;主要在中肠组织中高表达,而在其他组织中低表达。***和Bmclsp在不同抗性家蚕品系中应答NPV感染转录水平表达分析。以抗性品系A35和感性品系P50为材料分析Bmcoll和Bmclsp在不同抗性家蚕品系中应答NPV感染的表达分析,结果表明,Bmcoll的表达量在抗性品系中高于感性品系,在抗性品系A35中,Bmcoll对BmNPV感染存在应答现象;Bmclsp的表达量在抗性品系中高于感性品系,在抗性品系A35和感性品系P50中,Bmclsp对BmNPV感染均存在应答现象。***和Bmclsp在不同抗性家蚕品系中应答NPV感染蛋白水平的表达分析。对Bmcoll和Bmclsp进行原核表达,获得重组蛋白,制备了多克隆抗体。以Western Blot方法研究Bmcoll和Bmclsp在家蚕5龄中肠不同抗性品系感染BmNPV前后的蛋白水平的表达。结果表明:(1)Bmcoll蛋白,在P50和A35中Bmcoll的表达量均存在应答NPV感染的现象,且抗性品系A35添毒和对照组的表达量均明显高于感性品系P50;(2)Bmclsp蛋白,在P50和A35中Bmclsp的表达量均存在应答NPV感染的现象,Bmclsp在感性品系P50添毒后上调表达,而在抗性品系A35中下调表达。综上所述,本研究对家蚕消化液蛋白Bmcoll和Bmclsp进行鉴定及表达特性的分析,表明这两个蛋白都存在应答BmNPV侵染的特征,以上结果为深入研究家蚕Bmcoll和Bmclsp的相关功能和家蚕对病毒感染免疫应答的分子机制提供依据。

关键词：家蚕核型多角体病毒丝氨酸蛋白酶 collagenase chymotrypsin-like serine protease 应答

家蚕C8表皮形态突变体相关基因的鉴定与分析

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家蚕C8表皮形态突变体相关基因的鉴定与分析

作者：闻德夫安徽农业大学

学位级别：硕士

家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目、蚕蛾科,是鳞翅目昆虫的典型代表。随着家蚕基因组精细图的完成,人们对家蚕的研究正式进入后基因组时代。家蚕有400多种突变品系,其中表皮形态的突变体有枝蚕、竹蚕、石蚕等。对于引起表皮形态突变的基因... 详细信息

家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目、蚕蛾科,是鳞翅目昆虫的典型代表。随着家蚕基因组精细图的完成,人们对家蚕的研究正式进入后基因组时代。家蚕有400多种突变品系,其中表皮形态的突变体有枝蚕、竹蚕、石蚕等。对于引起表皮形态突变的基因及调控机制的研究尚处于起步阶段,许多表皮形态突变体的形成机制还有待研究。本研究以一种家蚕表皮形态突变体构建的近等基因系C8与其回交亲本C108为材料(家蚕C8与其回交亲本C108相比具有几个明显特征:体型细短、表皮硬实等),通过扫描电镜观察C8与C108表皮之间的形态结构差异;再以SDS-PAGE结合质谱分析鉴定在C8与C108之间差异表达的表皮蛋白,再通过对其cDNA序列的相似性分析,鉴定可能的突变基因,并用RT-qPCR分析其差异表达模式;进一步对候选基因进行连锁遗传分析,研究结果如下:1.C8表皮外表面上的外突比C108的更为明显,但C8的表皮比较致密,这种致密的表皮结构可能是引起C8表皮硬实的原因。2.利用SDS-PAGE筛选出8条在C8和C108表皮中差异表达的蛋白条带,并通过MALDI-TOF-MS质谱分析获得9个蛋白,其中含有3个表达差异的表皮蛋白:Bm CPH34、BmCPG4和BmCPR41,BmCPH34在C8中的表达量高于C108,而Bm CPG4和BmCPR41在C8中的表达量低于C108。3.对3个表皮蛋白基因:BmCPH34、BmCPG4和BmCPR41以及前期获得的在C8与C108中差异表达的表皮蛋白基因BmCPR2的cDNA序列进行克隆测序,结果表明:BmCPR2与BmCPR41基因所编码的氨基酸序列在C8与C108以及SilkDB数据库中的P50之间并没有差异;BmCPG4的基因的cDNA序列在C108和P50中存在较大差异,而在C8与P50之间只有1个碱基发生替换,并引起1个氨基酸残基发生突变。推测这3个基因并不是引起C8突变表型的直接因素。与C108和P50相比,BmCPH34基因的cDNA序列在C8中存在15 bp的碱基重复,并有9个碱基的替换,在其编码的氨基酸序列中存在5个氨基酸残基的重复,并引起2个位点的氨基酸的突变。我们推测,BmCPH34基因可能参与C8表皮形态突变的形成。4.利用RT-qPCR技术分别检测这4个表皮蛋白基因在C8与C108之间的表达差异,结果显示:4个表皮蛋白基因在C8中的表达量均高于C108,并且达到差异显著水平,表明这4个表皮蛋白基因在一定程度上参与C8表皮形态突变的形成。进一步对BmCPH34基因的发育时相分析表明该基因主要在家蚕的头、表皮、脂肪体和气管丛中表达,在家蚕幼虫四龄时表达量最高。因此,推测BmCPH34基因与C8表皮形态的形成存在着一定的联系。综上所述,在本研究中,我们共鉴定出4个可能与C8表皮形态突变相关的基因:BmCPH34、BmCPG4、BmCPR2和BmCPR41。但C8表皮形态形成的具体原因还需进一步研究。

关键词：近等基因系表皮形态突变蛋白差异表达 MALDI-TOF-MS 基因