检索结果-南通市图书馆

作者：秦艳丽河南师范大学

学位级别：硕士

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是一种同工酶,有三种亚型,Nos1、Nos2、Nos3,分别对应nNos,iNos,eNos。一氧化氮合酶2(NOS2)在细胞受到刺激被激活后发挥作用,所生成的NO数量较多。研究表明NOS2在慢性神经变性疾病、炎症、梗阻... 详细信息

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是一种同工酶,有三种亚型,Nos1、Nos2、Nos3,分别对应nNos,iNos,eNos。一氧化氮合酶2(NOS2)在细胞受到刺激被激活后发挥作用,所生成的NO数量较多。研究表明NOS2在慢性神经变性疾病、炎症、梗阻性病变、肿瘤、移植/植入、损伤、抗寄生虫感染中发挥重要作用,先前研究Nos2敲除在年轻小鼠中的作用,但其在老龄化小鼠肝损伤中的作用尚不清楚。随着老年人口逐渐增多,患有肝病需部分肝切除的老年人数也有了明显上升的趋势,而老年人大部分肝切除后有更高的死亡率和发病率。由NOS2合成的NO在肝脏部分切除后的肝脏再生中起着非常重要的作用。在该研究中,我们检测敲除Nos2基因对年老小鼠部分肝切除后肝脏再生的影响,用24个月大Nos2敲除的和野生型的C57BL/6小鼠进行2/3肝切除,收集肝切除后11个时间点的肝组织材料。手术后生存率,肝系数,即刻早期基因,增殖相关蛋白Ki67,细胞周期相关基因Cyclin A2,Cyclin D1,Cyclin B1,增殖通路相关蛋白JNK,NF-kB,STAT3及凋亡相关蛋白Caspase3,Caspase9,BCL2,BAX分别被检测。在肝再生的终止阶段,Nos2敲除的老年小鼠有更低的生存率(P=0.039)和较低的肝系数(从120小时到192小时,P=0.020,0.047和0.002);即刻早期基因Fos在肝再生的早期阶段表达上升,中后期阶段表达下降;Jun表达在肝再生早期无差异,中后期表达下降;Cyclin D1,Cyclin A2,Cyclin B1的表达降低和延迟;凋亡基因Caspase3,Caspase9的蛋白表达上升,促凋亡基因BAX的蛋白表达也上升。增殖相关转录因子STAT3,NF-kB,JNK表达下降和延迟。Nos2基因敲除的老年小鼠肝再生变慢,主要通过凋亡的增加和增殖变慢。CCl诱导的啮齿动物的急性肝衰竭与人类的急性肝衰竭在形态和生化观点上相似。由NOS2合成的NO在急性肝衰竭中起着重要的作用,在此实验中,我们研究Nos2敲除对CCl诱导的老年小鼠急性肝衰竭的影响,用CCl处理24个月大的Nos2敲除小鼠和野生型的C57BL/6小鼠,诱导急性肝衰竭,在处理后的不同时间点收集血清和肝组织材料。结果发现Nos2 KO小鼠血清中ALT、AST的含量在肝衰竭后大部分时间高于野生型小鼠中的含量,CCl处理的野生型小鼠中的Nos2基因的表达量比正常野生型小鼠高,在16h左右时达到最高,后期下降。炎症因子Tnf-a、IL-6、Ifn-γ、Emr1的mRNA表达量在Nos2 KO小鼠的大部分时间点比野生型小鼠高,并且Nos2 KO小鼠中的IL-6、Mcp-1、Ccr2的mRNA表达量升高比较明显。通过观察H.E染色的肝组织切片,Nos2 KO小鼠中CCl处理后期阶段的脂肪滴比野生型小鼠多和偏大,通过免疫印迹分析肝功能基因SOD2、BCHE的表达发现,Nos2 KO老年小鼠在急性肝衰竭过程中SOD2和BCHE的表达比野生型老年小鼠低。我们进一步检测凋亡相关基因Caspase3,Caspase9,Bcl2,Bax的表达变化,在Nos2 KO老年小鼠和WT老年小鼠中,细胞凋亡执行蛋白CASPASE3和CASPASE9的表达在CCl处理后的两种老年小鼠中后期都上升,且Nos2 KO老年小鼠的CASPASE3和CASPASE9的表达量高于WT老年小鼠。WT老年小鼠与Nos2 KO老年小鼠相比抑制细胞凋亡蛋白BCL2的表达量在部分时间点升高。Nos2 KO老年小鼠与WT老年小鼠相比促凋亡蛋白BAX的表达量在部分时间点较高。检测抗氧化和肝中毒后起保护作用的物质谷胱甘肽的变化,发现Nos2 KO小鼠比WT小鼠后期阶段浓度更低。Nos2基因敲除恶化了CCl诱导的老年小鼠的急性肝衰竭,主要通过炎症因子和凋亡的增加,肝功能蛋白和解毒物质的减少。

关键词： Nos2 基因敲除老年小鼠肝再生急性肝衰竭

从转录组和蛋白组水平研究大鼠肝再生中肝细胞增殖的途径和方式

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从转录组和蛋白组水平研究大鼠肝再生中肝细胞增殖的途径和方式

作者：梅金鑫河南师范大学

学位级别：硕士

肝脏具有多种生理生化功能和旺盛的再生能力。在受到物理、化学、生物或病理损伤后,残肝细胞迅速从静止期,即Go期进入细胞周期循环,以补偿损伤和／或丢失的肝组织和恢复肝脏的功能,此过程称为肝再生(liver regeneration, LR)。肝细胞是... 详细信息

肝脏具有多种生理生化功能和旺盛的再生能力。在受到物理、化学、生物或病理损伤后,残肝细胞迅速从静止期,即Go期进入细胞周期循环,以补偿损伤和／或丢失的肝组织和恢复肝脏的功能,此过程称为肝再生(liver regeneration, LR)。肝细胞是构成肝脏的主要细胞,约占肝脏细胞总数的65%、总肝量的70%-80%。研究表明,肝细胞增殖是大鼠肝再生的基础,受多种因素调控,涉及基因、蛋白、信号通路等的协同作用。目前,在肝再生机理研究方面,多集中于某个或某些基因／蛋白的作用,实际上肝再生涉及多种基因和蛋白,它们之间又形成复杂的相互作用关系,协同促进大鼠肝再生的完成。所以,只有从基因转录组与蛋白质组水平研究参与肝再生的基因／蛋白种类及其作用,才能较好地阐明肝再生的分子机制。为从转录组和蛋白组水平研究大鼠肝再生中肝细胞增殖的途径和方式,本研究用两步灌流结合Percoll密度梯度离心从大鼠再生肝中分离肝细胞,用Rat Genome 2302.0芯片检测大鼠2/3肝脏切除后Oh、2h、6h、12h、24h、30h、36h、72h、120h和168h等10个时间点肝细胞基因表达变化,用荧光差异双向电泳(2D-DIGE)检测上述10个时点肝细胞的蛋白表达变化,用质谱(MS)鉴定上述蛋白种类,用统计学方法分析其中的差异表达基因／蛋白和肝再生相关基因／蛋白,用IPA软件和KEGG PATHWAY网站等分析基因／蛋白互作,用谱函数(Ep(t))分析基因／蛋白表达变化预示的信号传导活动和肝细胞增殖活动。结果表明,4654个基因的表达变化大于或小于对照3倍,为肝再生中发生有意义表达变化基因。其中,表达上调、下调、上／下调的基因数分别为3869、703和82个。4602个基因在大鼠肝再生组(PH组)和手术对照组(SO组)的表达差异显著或极显著,为肝再生相关基因。其中,表达上调、下调、上／下调的基因数分别为3840、680和82个。同时,1169种蛋白的表达变化大于或小于对照2倍,为肝再生中发生有意义表达变化蛋白。其中,表达上调、下调、上／下调的蛋白数分别为793、242和134种。557种蛋白在PH组和SO组的表达差异显著或极显著,为肝再生相关蛋白。其中,表达上调、下调、上／下调的蛋白数分别为485、36和36种。查GO注释表明,这些基因／蛋白涉及信号传导、细胞增殖等33种生理活动。其中,635个基因和110种蛋白为细胞增殖信号通路成分,1220个基因和142种蛋白参与细胞增殖。分析基因／蛋白协同作用(Ep(t)值)预示的两种活动发现,在大鼠肝再生的6-72h,生长因子、趋化因子和JAK/STAT等三条信号通路的信号传导活动显著强于对照,它们调节的肝细胞增殖活动也于相应时间显著强于对照。网络分析发现,蛋白激酶AKT1处于三条信号通路的交汇点,且在转录水平和翻译水平表达上调。综合上述结果推测,生长因子、趋化因子和JAK/STAT等3条信号通路共同通过AKT1在鼠肝再生的进展阶段(PH后6-72h)促进肝细胞增殖。

关键词：大鼠肝再生肝细胞增殖转录组蛋白组网络分析

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急性肝功能衰竭相关基因和蛋白的研究

急性肝功能衰竭相关基因和蛋白的研究

作者：郭学强河南师范大学

学位级别：硕士

急性肝功能衰竭(或急性肝衰竭,acute hepatic failure,AHF)是多种诱因引起的、肝脏细胞受损严重并致使其多种功能发生障碍的病死率极高和对人们的健康威胁较大的一种肝脏疾病,常伴随多种器官衰竭、肝性脑病、血液动力学紊乱和多种代谢... 详细信息

急性肝功能衰竭(或急性肝衰竭,acute hepatic failure,AHF)是多种诱因引起的、肝脏细胞受损严重并致使其多种功能发生障碍的病死率极高和对人们的健康威胁较大的一种肝脏疾病,常伴随多种器官衰竭、肝性脑病、血液动力学紊乱和多种代谢疾病等并发症,因其发生机制复杂和影响因素多等原因,致使目前对其发病机理的研究虽然较多但仍尚不完全清楚,且仍没有发现对其有效的防御和治疗办法,目前仍以综合治疗为主,故而一直以来急性肝衰竭都是临床医学上最具挑战的疾病之一。为此,本文成功构建了大鼠AHF模型,并通过检测其血清ALT和AST两种酶活性、计算其肝系数和冰冻切片显微镜检检验建模效果;Rat Genome 230 2.0基因芯片检测其基因表达变化发现了4819个AHF相关基因,IPA分析其相关基因表达变化发现,IL-1、IL-6和IL-8等信号通路信号传导活动增强,TP53、ATM和AMPK等减弱;细胞存活、增殖和分化等生理活动增强,T/B淋巴细胞凋亡减弱;分析AHF发生机理相关基因表达变化后预测,通过IL-1α→IL-1R1→→MAPK8→FOS/JUN和/或TNFα→TNFRSF1A/B→→Caspases途径在AHF损伤和进展阶段调节细胞凋亡、炎症和免疫反应,炎症因子通过NF-κB途径在进展阶段调节细胞凋亡,TP53在进展阶段抑制细胞凋亡,恢复阶段细胞凋亡被抑制(此时Caspase3表达下调),进展和恢复阶段通过肝细胞增殖来修复其损伤(PCNA表达上调),因此,本文推测,在CCl4诱导的急性肝衰竭中,IL-1R1、TNFRSF1A/B、Caspase3、TP53、PCNA和NF-κB等基因/蛋白起重要作用。本文选择使用本实验室所创的液压转基因技术(hydrodynamics-based transgene,HDT)对小鼠AHF进行基因治疗初探,通过血清ALT和AST和冰冻切片显微检测鉴定小鼠AHF模型建立成功,通过不同注射方式条件摸索(液压转基因注射生理盐水/空载体质粒-生理盐水溶液与灌胃建模的前后和不同时间差)发现,灌胃建模后6h,液压转基因注射空载体质粒pEGFP-C1与液压转基因注射生理盐水相比,对小鼠AHF形成的影响结果无显著性差异,从而为AHF的基因治疗打下一定基础。综上所述,本文进一步阐述和分析了AHF的发生机理,探索了液压转基因目的基因进入AHF模型体内的最佳注射条件,为更进一步的研究及其治疗奠定基础。

关键词：急性肝功能衰竭四氯化碳 Rat Genome 230 2.0芯片基因治疗液压转基因

从转录水平研究NIH3T3细胞周期进程中基因表达的差异与功能

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从转录水平研究NIH3T3细胞周期进程中基因表达的差异与功能

作者：王一雯河南师范大学

学位级别：硕士

为从转录水平研究永生化的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞周期进程中的基因表达差异与功能,本文通过血清饥饿法建立NIH3T3细胞周期模型,用Mouse Genome 430 2.0芯片检测细胞周期过程中相关基因的表达丰度,用IPA软件、QIAGEN和KEGG PATHWAY等... 详细信息

为从转录水平研究永生化的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞周期进程中的基因表达差异与功能,本文通过血清饥饿法建立NIH3T3细胞周期模型,用Mouse Genome 430 2.0芯片检测细胞周期过程中相关基因的表达丰度,用IPA软件、QIAGEN和KEGG PATHWAY等网站资料分析基因表达变化预示的信号通路对细胞周期进程的调节作用,并以c-FOS和NKX2-5为切入点,对NIH3T3细胞进行慢病毒转染,初步探究二者对小鼠成纤维细胞周期的调控作用影响。芯片数据分析表明,2349个基因的ratio值大于对照3倍,为上调基因。2255个基因的ratio值小于对照3倍,为下调基因。55个基因表达上下调。上述基因共计4659个,统称为有意义表达变化基因。GO注释分类表明,这些有意义表达变化的基因涉及细胞增殖和细胞周期等33种生理活动。在这些有意义表达变化基因中,有891个基因为细胞周期相关基因,其中的548个基因表达上调,336个基因表达下调,7个基因表现上下调。114个细胞周期信号通路相关基因发生了有意义的表达变化。基因协同作用(Ep(t)值)分析发现,主要5条信号通路PI3K,STAT3,钙蛋白酶,RHO家族鸟苷酸激酶,VEGF等信号通路(依次对应于促进G1期,G1/S转换期,S期,G2/M转换期和M期周期)促进NIH3T3细胞周期进程,它们调节的G1期、G1/S期、S期、G2/M期和M期生理活性与上述信号传导活动呈正相关。通过对芯片数据统计分析,以c-FOS和NKX2-5两个基因为切入点,用慢病毒转染法对NIH3T3细胞侵染,研究二者对该细胞的作用和影响。根据现有资料可知,这是首次系统并且全面地分析研究NIH3T3细胞周期信号传导过程。结果发现,只有c-FOS能在NIH3T3细胞中过量表达,NKX2-5在NIH3T3细胞中的表达量则极低。进一步查阅相关文献后得出结论,c-FOS基因不能诱导NIH3T3细胞恶性增殖,NIH3T3的细胞周期不会发生改变;NKX2-5不能诱导NIH3T3细胞发生转化。

关键词： NIH3T3 细胞周期信号通路细胞转染

毕赤酵母菌表达重组豹蛙抗瘤酶（rrONC）及其生物学作用分析

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毕赤酵母菌表达重组豹蛙抗瘤酶（rrONC）及其生物学作用分析

作者：张瑞刚河南师范大学

学位级别：硕士

豹蛙酶的核糖核酸酶活性低，细胞毒性强，对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用，是当前全球重点研究的100种新药之一。为此，本文构建了pPIC9K-rrONC表达载体，用毕赤酵母GS115为受体菌，从重组酵母菌中筛选出能正确表达重组豹蛙抗瘤酶（r... 详细信息

豹蛙酶的核糖核酸酶活性低，细胞毒性强，对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用，是当前全球重点研究的100种新药之一。为此，本文构建了pPIC9K-rrONC表达载体，用毕赤酵母GS115为受体菌，从重组酵母菌中筛选出能正确表达重组豹蛙抗瘤酶（rrONC）的工程菌株，然后对该工程菌的摇瓶发酵条件、产物分离纯化方法以及rrONC体外生物学作用进行了研究。本文在构建工程菌时采用了适合该菌株的分泌型表达载体pPIC9K，并成功构建了重组表达质粒pPIC9K-rrONC。该质粒经电转化整合至毕赤酵母GS115的基因组中，再经过基因组PCR筛选，MM和MD平板筛选，BMGY/BMMY培养基培养，SDS-PAGE鉴定等步骤检测，最终获得了可以正确表达rrONC的工程菌株。然后进一步在摇瓶条件下，对其表达量与时间关系进行研究，发现随着诱导时间的延长，该蛋白的表达量呈正态曲线，并在120h达到高峰。本文用BMGY/BMMY培养基，对工程菌在1L摇瓶中的各种发酵条件进行了优化摸索。结果发现，在1L摇瓶中工程菌表达重组豹蛙酶的最佳条件是菌液体积100ml，转速200rpm，pH5.5，温度25℃，甲醇浓度1%，硫酸铵浓度0.5%以及磷酸盐浓度100mM。本文摸索了分离纯化rrONC的条件，结果表明，运用等电点沉淀、低温乙醇分级沉淀以及超滤依此对rrONC的摇瓶发酵液进行分离纯化，可获得纯度90%左右的目的产物。本文初步检测了rrONC对羊膜细胞WISH和九种癌细胞的体外生物学活性，MTT法测得结果发现rrONC对十种细胞的活性均有抑制作用，其抑制作用与浓度成正相关性;Hoechst33258染色结果表明，在0.5*IC50、IC50和2*IC50三种不同药物浓度下，rrONC都能促进上述十种细胞不同程度的凋亡。从而为进一步搞清rrONC的细胞毒性机理奠定了基础。

关键词：重组豹蛙酶毕赤酵母表达条件优化纯化

PMA诱导NIH3T3细胞转化的分子机理研究

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PMA诱导NIH3T3细胞转化的分子机理研究

作者：和婷婷河南师范大学

学位级别：硕士

为了研究化学物质诱导细胞发生转化的机理，本研究首先建立体外NIH3T3细胞的二阶段化学转化模型，即先用致癌剂3-甲基胆蒽（3-methylcholanthrene，3-MCA）启动细胞发生DNA损伤，再用诱癌剂佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PM... 详细信息

为了研究化学物质诱导细胞发生转化的机理，本研究首先建立体外NIH3T3细胞的二阶段化学转化模型，即先用致癌剂3-甲基胆蒽（3-methylcholanthrene，3-MCA）启动细胞发生DNA损伤，再用诱癌剂佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）诱导细胞发生促癌转化。另外，转化过程中改变培养基条件和降低血清浓度，使对血清依赖程度降低的转化细胞生长增殖不受影响，而未转化的细胞生长则受到抑制。Giemsa染色证实转化细胞具有癌前细胞特征，如嗜碱性增强，成交叉和漩涡状复层堆积生长。甲基纤维素成集落实验表明，转化细胞呈现癌细胞所具备的向周围正常细胞侵润的能力。转化的细胞呈现多层堆积生长、向周围细胞侵润力增强等特性，说明细胞转化过程与细胞的恶性增殖密切相关。本研究用生物信息学和系统生物学方法从转录组水平研究PMA诱导NIH3T3细胞转化过程中不同阶段细胞增殖的途径和方式，从而揭示其诱导NIH3T3细胞转化的机理。用Mouse Genome4302.0芯片检测药物处理组和实验对照组细胞转化各时间点的基因表达丰度，根据基因表达丰度计算ratio值。发现1956个基因的ratio值大于对照3倍，称为上调基因，1196个基因的ratio值小于对照3倍，称为下调基因，23个基因的ratio值在有的时间点大于对照3倍，有的时间点小于对照3倍，称为上下调基因，共计3175个基因，统称为有意义表达变化基因。F检验发现，其中的484个基因与细胞转化相关。查GO注释表明，这些基因涉及信号传导、细胞增殖等33种生理活动，138个基因参与细胞增殖信号通路，166个基因参与细胞增殖。用网络原理和方法分析基因表达变化预示的信号传导活动和细胞增殖两种活动（Ep(t)值）发现，NIH3T3细胞转化中HGF、NF-κB和STAT3通路的信号传导活动在8d与对照无差异，在22-34d显著强于对照，mTOR通路的信号传导活动在8-34d显著强于对照，ErbB2通路的信号传导活动在8d和34d显著强于对照，它们调节的细胞增殖活动在8d与对照无差异，在22-34d显著强于对照，表明这些信号通路通过调节细胞转化过程中不同阶段细胞的增殖活动从而促进细胞转化。综上所述，本研究通过高通量分析细胞转化不同阶段的基因表达变化，采用生物信息学和系统生物学方法构建信号通路网络，分析出起重要作用的通路和分子，从而得出HGF、NF-κB、STAT3、mTOR、ErbB2等五条信号通路调节PMA诱导NIH3T3细胞转化过程中不同阶段的细胞增殖活动，从而促进细胞转化。

关键词：细胞转化 PMA 细胞增殖信号传导

中国大鲵禁食过程中肺生理生化的蛋白表达与效应研究

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中国大鲵禁食过程中肺生理生化的蛋白表达与效应研究

作者：张婷河南师范大学

学位级别：硕士

中国大鲵(Andrias davidianus)是现存大鲵种类中体型最大的一种比较原始的两栖动物,幼体用外腮呼吸,发育成体后外鳃消失改用肺呼吸。大鲵由从水生到陆生的过渡性身体结构和遗传的多样性都表明大鲵有很大的研究价值。目前研究有关大鲵禁... 详细信息

中国大鲵(Andrias davidianus)是现存大鲵种类中体型最大的一种比较原始的两栖动物,幼体用外腮呼吸,发育成体后外鳃消失改用肺呼吸。大鲵由从水生到陆生的过渡性身体结构和遗传的多样性都表明大鲵有很大的研究价值。目前研究有关大鲵禁食蛋白组学方面比较少。肺是两栖动物体内重要的器官,在物质运输、生物氧化等方面发挥不可替代的作用。两栖类处于由水生动物向陆生动物进化的过渡阶段,对其肺呼吸活动方式的研究有助于了解脊椎动物呼吸系统的进化过程。从蛋白质组学水平研究肺在耐饥饿中的作用,有助于丰富对肺功能的认识和了解动物的饥饿适应性机理。本课题以中国大鲵禁食过程中肺为研究对象,用质谱鉴定技术、双向电泳并结合同位素标记相对和绝对定量技术,整合了有关中国大鲵禁食过程中肺蛋白的表达丰度等数据,通过IPA软件和相关网站对所得蛋白数据进行生物信息学分析,共从以下两个生理活动讨论了中国大鲵禁食过程中肺呼吸的相关蛋白:(1)物质运输相关:在中国大鲵禁食中451种蛋白直接参与物质运输,涉及氨基酸及其衍生物运输、蛋白定位与运输、碱基与核苷及核苷酸运输、DNA运输、RNA运输、脂类运输、糖类运输、维生素与辅酶运输、有机酸运输、离子运输、囊泡介导的运输等。237种蛋白参与调节物质运输的信号通路,包括腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、钙离子(Calcium)、细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)等11条物质运输相关信号通路。(2)生物氧化相关:在中国大鲵禁食中113种蛋白直接参与生物氧化,涉及生物氧化、氧化还原、电子传递链、过氧化氢代谢、超氧化物代谢等。125种蛋白参与调节生物氧化的信号通路,包括腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路。相应的蛋白功能和软件分析证明大鲵禁食肺中生理活动和信号通路活动均有比较明显的变化。研究结果表明,中国大鲵禁食过程中肺的蛋白质的表达活动随着时间的增强而有着明显的变化。

关键词：中国大鲵禁食蛋白质组学肺

α-L-Asp-Asp和α-L-Lys-Lys的固相合成工艺研究

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α-L-Asp-Asp和α-L-Lys-Lys的固相合成工艺研究

作者：王书佩河南师范大学

学位级别：硕士

研究表明,氨基酸及其类似物、聚合物有重要的药理作用潜力。同时,天冬氨酸或赖氨酸类多肽化合物具有抗肿瘤作用,固相合成法为合成氨基酸及其类似物、聚合物提供了技术支持。为此,本研究拟采用Fmoc固相合成方法合成a-L-Asp-Asp和a-L-Lys-... 详细信息

研究表明,氨基酸及其类似物、聚合物有重要的药理作用潜力。同时,天冬氨酸或赖氨酸类多肽化合物具有抗肿瘤作用,固相合成法为合成氨基酸及其类似物、聚合物提供了技术支持。为此,本研究拟采用Fmoc固相合成方法合成a-L-Asp-Asp和a-L-Lys-Lys。研究过程如下。将wang-树脂和氨基酸按摩尔投料比1：4加入到10ml DMF溶液中,于室温搅拌反应8小时,得到双保护的产物Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-树脂、Fmoc-Lys(Boc)-Ala-树脂、Fmoc-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-树脂和Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ala-树脂,然后加入10ml20%哌啶的DMF溶液到双保护的产物中进行脱氨基保护反应,得到脱氨基保护的产物NH2-Asp(OtBu)-Ala-树脂、NH2-Lys(Boc)-Ala-树脂、NH2-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ala-树脂和NH2-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ala-树脂,再加入10ml95%TFA的水溶液进行切割的树脂反应和脱羧基保护反应,得到a-L-Asp-Ala、 a-L-Lys-Ala、a-L-Ala-Asp-Asp a-L-Ala-Lys-Lys四种化合物,为下一步制备目的产物a-L-Asp-Asp和a-L-Lys-Lys提供材料,为后期检测它们的生物活性奠定了基础。本文用反相高效液相色谱分离目的物。即在紫外检测波长为250nm、柱温为室温的条件下,每次手动进样到高效液相色谱仪,对天冬氨酸及赖氨酸类多肽化合物粗品进行分离纯化,得到纯度98%以上的产物。本文用MS-ESI质谱鉴定上述产物表明,其相对分子量与理论值一致。用质谱、红外光谱、核磁氢谱等进行等分析测试手段进行化学结构的表征表明,其上述产物的化学结构正确。本实验操作过程简便,反应条件温和,合成和后处理步骤简单,产率较高,为完成目标产物a-L-Asp-Asp和a-L-Lys-Lys的合成奠定了基础。

关键词：固相合成多肽高效液相色谱质谱树脂

重组大鼠白细胞介素18（rrIL-18）的毕赤酵母表达及其对大鼠肝细胞和肿瘤细胞的作用研究

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重组大鼠白细胞介素18（rrIL-18）的毕赤酵母表达及其对大鼠肝细...

作者：孙冬冬河南师范大学

学位级别：硕士

白细胞介素18(IL-l8)又称IFN-γ诱导因子(IGIF)，是上世纪90年代发现的一种细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生。IL-18能够诱导Thl、NK、T细胞产生IFN-γ，具有抗肿瘤、抗病原微生物以及抗超敏反应等生物学功能，另外IL-l8还与I型糖尿... 详细信息

白细胞介素18(IL-l8)又称IFN-γ诱导因子(IGIF)，是上世纪90年代发现的一种细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生。IL-18能够诱导Thl、NK、T细胞产生IFN-γ，具有抗肿瘤、抗病原微生物以及抗超敏反应等生物学功能，另外IL-l8还与I型糖尿病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关。由此可见，IL-18具有多种生物学功能并且有潜在的临床应用价值。本文研究了大鼠白细胞介素18在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达，并摸索了重组大鼠IL-18的纯化工艺，以及rrIL-18对大鼠肝细胞的增殖作用研究。本文研究不同载体-菌株组合对rrIL-18表达水平的影响时发现：在表达rrIL-18时，pPICZα系列载体作为表达载体要优于pPIC9系列表达载体;而选用X-33菌株的rrIL-18表达水平要优于GS115菌株，说明选用X-33作为宿主菌有利于提高rrIL-18的表达量。本文研究3L发酵罐规模下不同因素对rrIL-18表达水平的影响时发现，不同的起始诱导密度、溶解氧体积分数(DO)、pH、温度、甲醇浓度以及甘油添加量等培养条件对rrIL-18表达水平均有影响。最佳表达条件为一级种子以10%的接种量接入基础盐培养基中，起始诱导密度为750，发酵过程中保持DO在20%，诱导温度22℃，pH=5.75，甲醇电极控制甲醇浓度在0.25%，诱导过程中添加甘油2g/(L·h)，发酵全过程由发酵罐控制系统进行在线控制和数据采集。最佳表达条件下，诱导144h后rrIL-18表达量接近0.35g/L。本文摸索了分离纯化rrIL-18的条件，结果表明，运用超滤、等电点沉淀、乙醇沉淀以及疏水层析依次对rrIL-18的3L发酵液进行分离纯化，可获得纯度90%左右的目的产物。本文初步检测了rrIL-18对大鼠肝细胞生长增殖作用，BrdU免疫荧光法测得结果发现rrIL-18对大鼠肝细胞有增殖作用，其增殖作用随浓度的升高而增强;但当其浓度超过一定值后对肝细胞的增殖作用不明显。从而为进一步搞清rrIL-18的其它生物学作用奠定了基础。

关键词：毕赤酵母重组大鼠白细胞介素18 rrIL-18的表达分离纯化肝细胞

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大鼠肝再生过程中差异表达的基因分析

大鼠肝再生过程中差异表达的基因分析

作者：汤祥忠华中师范大学

学位级别：硕士

大鼠肝在经过部分肝切除诱导后具有极强的再生能力，这一生物学过程中涉及到了哺乳动物组织和器官重建、细胞增殖、分化与去分化、生理生化调控等生命科学的核心问题。在这一过程中大量基因的表达从量和质两方面发生了变化。找到这些差... 详细信息

大鼠肝在经过部分肝切除诱导后具有极强的再生能力，这一生物学过程中涉及到了哺乳动物组织和器官重建、细胞增殖、分化与去分化、生理生化调控等生命科学的核心问题。在这一过程中大量基因的表达从量和质两方面发生了变化。找到这些差异，理清其内在联系和与肝再生的确切关系是阐明肝再生分子机理的前提。本研究以徐存拴等建立的短间隔连续部分肝切除(short interval successive partial hepatectomy，SISPH)0-4-36-36-36h为实验模型，以76h和112h再生肝为实验材料，提取其mRNA反转录成cDNA，运用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)构建了高效正向消减cDNA文库，文库包含了0-4-36-36-36h SISPH中112h较76h上调表达的差异表达的EST片段。并从中筛选出了53个EST片段对其进行了序列分析和同源性检索，其中28个EST片段和报道的基因有100％同源性，有25个EST片段和报道过的基因有差异但高度同源。这些基因中有和肝再生有直接关系的如：胎球蛋白、组织蛋白酶;和肝脏功能密切相关的如：胞质天冬氨酸转氨酶、谷胱甘肽硫转移酶;与物质能量代谢有关的如：ATP合成酶、核糖体蛋白;以及与急相反应有关的如：触珠蛋白、转铁蛋白。这些EST的克隆为进一步研究相关基因在肝再生过程中的作用奠定了基础。

关键词：大鼠肝再生短间隔连续部分肝切除正向消减cDNA文库抑制性消减杂交同源性检索 EST