检索结果-南通市图书馆

作者：赵旺中国矿业大学

学位级别：硕士

汽油是一种挥发性强的轻质油品,在运输、使用过程中易蒸发污染大气。目前,国内外对汽油蒸发排放的控制主要采用以活性炭为吸附剂的炭罐,用来吸附引擎停止工作时未燃尽而逸出的汽油蒸气,引擎再次起动时通过空气吹扫将活性炭中吸附的汽油... 详细信息

汽油是一种挥发性强的轻质油品,在运输、使用过程中易蒸发污染大气。目前,国内外对汽油蒸发排放的控制主要采用以活性炭为吸附剂的炭罐,用来吸附引擎停止工作时未燃尽而逸出的汽油蒸气,引擎再次起动时通过空气吹扫将活性炭中吸附的汽油解吸出来,一同进入气缸燃烧。我国已经是世界第一大汽车生产国和消费国,每年需要大量的特种活性炭制造炭罐,所以研究高效汽油蒸气吸附的活性炭具有重要意义。本文通过对原料配比、炭化温度、炭化升温速率、活化温度、烧失率等工艺参数的研究,以强度和丁烷工作容量为指标,确定了最佳制备工艺条件,并研究了活性炭的丁烷吸附性能与孔隙结构的关系,确定了适合正丁烷吸附的最佳孔径范围。此外,本文还研究了碘值、亚甲基蓝值、焦糖脱色率与丁烷吸附性能的关系。最后,通过对活性炭吸附正丁烷进行动力学分析,确定出合适的动力学方程,为活性炭在汽油吸附领域的应用提供一定的理论指导。实验条件下,最佳参数及工艺条件为:煤种配比(大同:山东)为9:1,炭化温度为650℃,炭化升温速率为12℃/min,活化温度为960℃,烧失率为85%。在此条件下制得强度为92.0%,表观密度为0.296,丁烷工作容量为11.70g/100mL,比表面积1494m2/g,总孔容1.11cm3/g的活性炭。烧失率对活性炭的强度和丁烷吸附性能有显著影响,烧失率越高,活性炭的强度越低,但丁烷吸附性能越好。控制烧失率在80%-85%之间有助于在保证活性炭强度的同时提高丁烷吸附性能。较高的炭化温度得到的炭化料活化后孔隙较发达,有利于活性炭的丁烷吸附性能的提高。较慢的炭化升温速率会减少生成胶质体的数量,活性炭的孔隙较发达,丁烷的吸附性能较好,但是煤粉颗粒无法充分黏结,从而强度较低。活化温度对活性炭性能影响不大,较高的活化温度能缩短生产周期。对活性炭丁烷吸附性能和孔隙结构的关系进行分析,结果表明,总孔容和平均孔径的增大有利于丁烷工作容量的提高。孔径范围1.42-4.82nm之间的孔容有利于活性炭丁烷工作容量的提高,而0.79-1.10nm之间的孔容会导致活性炭丁烷持附性的增大。对活性炭常规指标和丁烷吸附性能指标的分析,发现活性炭的丁烷吸附性能与焦糖脱色率和亚甲基蓝值的线性关系较好,与碘值没有线性关系。并且,焦糖脱色率在60%以上,亚甲基蓝值在320mg/g以上的活性炭的丁烷工作容量较高,高于10g/100mL。对活性炭进行丁烷吸附动力学试验,结果表明:温度主要影响丁烷饱和吸附量,温度越低,饱和吸附量越高;丁烷气体的流量主要影响达到吸附平衡所需的时间,丁烷气体流量越大,越快达到吸附平衡。通过氮气吹扫的脱附过程与温度的关系不大;氮气的流量对丁烷的脱附量有影响,氮气流量越大,丁烷脱附量越高。通过动力学方程拟合发现,Bngham动力学方程对吸附和脱附实验数据的拟合程度很好,相关系数R2达0.99,此方程能很好地描述活性炭对丁烷的吸附和脱附过程。

关键词：活性炭工艺条件丁烷工作容量强度动力学

双蜗壳混流泵内部流场数值模拟及叶轮力学特性分析

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双蜗壳混流泵内部流场数值模拟及叶轮力学特性分析

作者：吴俊华中科技大学

学位级别：硕士

随着科学技术的不断发展,现代工农业对于水力机械各方面的性能也提出了更高的要求,在空化和汽蚀现象不是很严重的情况下,效率,强度和稳定性无疑成为三个最为重要的性能指标,效率关系到对能量的利用,强度关系到做功部件叶轮的寿命,而稳... 详细信息

随着科学技术的不断发展,现代工农业对于水力机械各方面的性能也提出了更高的要求,在空化和汽蚀现象不是很严重的情况下,效率,强度和稳定性无疑成为三个最为重要的性能指标,效率关系到对能量的利用,强度关系到做功部件叶轮的寿命,而稳定性则关系到机组是否能安全,正常的运行,事实上他们之间并不是相互独立的,而是紧密联系在一起的,因此探讨这三个重要的性能指标之间的关系也就成了水力机械设计过程中不可避免的敏感话题。本文以某一双蜗壳式混流泵为研究对象,以计算流体动力学为理论基础,运用先进的计算机数值计算技术,对混流泵整机模型在多个工况点下进行全三维的定常湍流数值模拟,揭示了三种特征工况点下其内部流场的主要机理,同时对叶轮做出必要的优化改型,从而提高了设计工况点下的效率,为探讨混流泵机组的稳定性,还对上述计算模型进行非定常的湍流数值模拟,详细分析了混流泵内部流场各监测点压力脉动的变化情况。此外,大量文献报道由于水力机械机组的叶轮受到持续的疲劳破坏,其叶片发生裂纹或者断裂现象,并且整个机组还伴随着强烈振动与机械噪音,对此,本文应用流固耦合技术对混流泵叶轮进行静力强度和模态的力学特性分析,为混流泵通流部件的强度设计与校核及机组的振动分析提供一定的参考依据。综合以上的因素,我们必须注意到在水力机械设计阶段不能只是一味地追求效率,还应顾及强度及稳定性方面的制约,以研制和开发出既高效节能,又运行平稳安全可靠的水力机械产品为出发点,不断完善其结构和性能。

关键词：双蜗壳混流泵数值模拟优化改型流固耦合

人B淋巴细胞刺激因子的克隆、表达、纯化及活性研究

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人B淋巴细胞刺激因子的克隆、表达、纯化及活性研究

作者：梅晶晶南京师范大学

学位级别：硕士

人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)是一种B淋巴细胞的共刺激因子，属TNF超家族成员。本文一方面利用巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)这一真核表达系统成功构建、表达了hBAFF蛋白;同时对毕赤酵母分泌表达得到的hBAFF进行SDS-PAGE、Western blo... 详细信息

人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)是一种B淋巴细胞的共刺激因子，属TNF超家族成员。本文一方面利用巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)这一真核表达系统成功构建、表达了hBAFF蛋白;同时对毕赤酵母分泌表达得到的hBAFF进行SDS-PAGE、Western blotting、ELISA等方面的检测。另一方面将hBAFF基因通过柔性臂(GlySer)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)相连，通过大肠杆菌(***)表达系统进行融合蛋白的表达;并对表达蛋白做Western blotting、荧光及B淋巴细胞增殖的活性测定。实验设计及结果如下： 1 EGFP-hBAFF融合蛋白的表达纯化及活性测定将人B淋巴细胞刺激因子和增强型绿色荧光蛋白通过(GlySer)linker相连接，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白EGFP-hBAFF;并对该蛋白进行Ni-IDA亲和层析柱纯化，纯化的蛋白经检测具有EGFP的荧光活性和hBAFF的B淋巴细胞增殖活性。 2 hBAFF在毕赤酵母中的表达及产物鉴定克隆得到hBAFF基因与穿梭载体pPIC9连接得到pPIC9-hBAFF重组质粒，线性化后电转酵母菌GS115中，挑选出阳性重组子进行诱导表达;并对表达条件优化，表达产物进行Western blotting、ELISA方面的检测。结果表明，当甲醇浓度为1％、诱导时间为72h、温度为20℃时hBAFF蛋白表达量最高。

关键词：人B淋巴细胞刺激因子绿色荧光蛋白大肠杆菌毕赤酵母细胞增殖

豚鼠、罗非鱼GILT的分子结构及生物学性质研究

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豚鼠、罗非鱼GILT的分子结构及生物学性质研究

作者：马莉南京师范大学

学位级别：硕士

以Ⅱ型组织相容性抗原复合物为基础的抗原呈递需要将天然蛋白加工成短肽以适应MHC的结合和T细胞受体的识别。抗原呈递细胞中进行的抗原加工涉及抗原的变性、去折叠、二硫键的还原及蛋白质的水解,其中二硫键的还原是至关重要的步骤。GILT... 详细信息

以Ⅱ型组织相容性抗原复合物为基础的抗原呈递需要将天然蛋白加工成短肽以适应MHC的结合和T细胞受体的识别。抗原呈递细胞中进行的抗原加工涉及抗原的变性、去折叠、二硫键的还原及蛋白质的水解,其中二硫键的还原是至关重要的步骤。GILT(全称γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶)具有还原二硫键的活性,因此能够促进天然蛋白抗原的去折叠和进一步蛋白酶解。在专门的抗原呈递细胞中,GILT在低pH条件下有着较高的活性,并且在抗原加工及免疫显性表位显示中起重要作用。另外,GILT在中和胞外病原体和清除感染细胞碎片方面也有作用。近来研究表明,GILT在细胞中的缺失与表达会影响到对病毒、肿瘤、细菌、抗原等的免疫应答,并且可能影响自身免疫疾病的发生发展。例如,GILT在T细胞中的表达会降低T细胞的敏感性并且降低自身免疫应答。GILT是李斯特氏菌的关键宿主因子,会引起鱼类、鸟类及哺乳类动物致病。这些均表明GILT可以被应用于医学研究领域及治疗自身免疫性疾病,从而为新的预防与治疗疾病提供一定的参考价值。溶菌酶(LYZ)是一种碱性球蛋白,酶的活性中心是天冬氨酸和谷氨酸。LYZ是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,亦称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶,它能够专一地作用于肽聚糖分子中的β-1,4-糖苷键,从而破坏细菌的细胞壁,最终使细菌裂解死亡。溶酶体是一种先天性免疫系统的组成部分,主要由单核巨噬细胞分泌产生,在机体中起着非特异性的防御作用,它具有抗菌、消炎、抗病毒等多种作用。作为一种无毒副作用的人体内蛋白质,溶菌酶是一种比较安全的食品保鲜剂和防腐剂,已成为科研领域的研究热点。第一部分:豚鼠和罗非鱼GILT基因结构、表达及其生物学活性分析。通过RT-PCR分别从豚鼠、罗非鱼脾脏组织中扩增得到了 705bp的Cavia porcellus GILT(cpGILT)和756bp的Oreochromis niloticus GILT基因(onGILT)。CpGILT基因的CDS区编码234个氨基酸,在线预测其相对分子质量为25.85 kDa;OnGILT基因的CDS区编码252个氨基酸,在线预测其相应蛋白质的分子量约为27.8kD,等电点理论值PI=5.86。通过软件预测三维结构显示onGILT以及cpGILT和人、鼠GILT的结构相似。两者GILT蛋白质均包含有GILT蛋白的特征序列:CXXC和CQHGX2ECX2NX4C,且进化分析表明两者GILT和与其他物种的GILT起源于同一祖先。荧光定量PCR实验表明,两者GILT的表达均具有组织特异性,并且经过LPS刺激后表达量在脾脏和肾脏组织中得到上调。我们通过构建融合表达载体,高效表达了重组蛋白质PET28a-cpGILT和PET28a-onGILT,并对其进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。接着以人IgG为底物,测定了 cpGILT和onGILT的巯基还原酶活性。最后,通过细胞转染及免疫荧光技术,采用亚细胞定位分析了cpGILT/onGILT和hGILT的定位。实验结果表明,cpGILT和onGILT均能够还原二硫键,对动物机体的天然免疫防护具有重要作用,cpGILT/onGILT的亚细胞定位与hGILT相类似,并且它们的定位与抗原呈递细胞中发现的定位是相一致的,这为以后探究GILT在鱼类和哺乳动物中的新作用提供了参考和依据。第二部分:家兔LYZ的基因结构、表达及其生物学活性分析。本文以家兔作为研究对象,利用Trizol法从家兔脾脏组织中提取RNA,经过RT-PCR 扩增得到长为 432bp 的 Oryctolagus cuniculus LYZ 基因(ocLYZ),ocLYZ 基因CDS区编码144个氨基酸,在线预测其相对分子质量为16.17kDa,并利用MEGA软件分析了其进化地位。通过荧光定量PCR对LYZ基因在不同组织中的表达进行了分析,利用基因工程技术,构建重组表达载体PET28a-ocLYZ,诱导表达了融合蛋白质,并运用孔穴法对其生物学活性进行测定,最后探究了 ocLYZ的最佳作用pH和温度。这些结果表明,ocLYZ具有抑菌作用,对机体的天然免疫防护有重要作用,这也为进一步研究溶菌酶奠定了基础,提供新的研究依据,供人们更充分地加以利用。

关键词：豚鼠罗非鱼 γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶家兔溶菌酶

虹鳟鱼γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶及LIGHT（TNFSF14）的克隆、表达及生物学活性研究

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虹鳟鱼γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶及LIGHT（TNFSF14）的克隆、...

作者：刘萌南京师范大学

学位级别：硕士

干扰素-γ诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)在MHCⅡ抗原呈递过程中起着还原二硫键的关键作用。LIGHT是TNF家族第14号成员,它在诱导肿瘤细胞凋亡、T细胞的共刺激、淋巴样结构的发生与发育、树突状细胞的活化等过程中发挥着重要的作用。本文... 详细信息

干扰素-γ诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)在MHCⅡ抗原呈递过程中起着还原二硫键的关键作用。LIGHT是TNF家族第14号成员,它在诱导肿瘤细胞凋亡、T细胞的共刺激、淋巴样结构的发生与发育、树突状细胞的活化等过程中发挥着重要的作用。本文运用PCR、Real-time PCR,大肠杆菌原核表达、Western bloting等分子生物学技术以及一些生物信息学方法,对虹鳟鱼的GILT (rGILT)和LIGHT (rLIGHT)的核苷酸序列、氨基酸序列、组织分布及重组蛋白部分生物学活性等方面进行了分析和研究。结果如下： 1虹鳟鱼GILT的克隆、表达以及活性研究从虹鳟鱼脾脏中提取RNA继而扩增得到虹鳟鱼GILT基因(简称rGILT)。 rGILT的cDNA序列长为762bp,编码253个氨基酸,蛋白分子量约为28.23kDa,其理论等电点约为4.94。虹鳟鱼GILT蛋白包含GILT蛋白的特征性结构序列：CXXC基序和CQHGX2ECX2NX4C。且进化分析表明rGILT与其他物种的GILT起源于同一祖先。实时定量PCR结果表明,rGILT的表达具有组织特异性,并且经过LPS刺激后,其在脾脏细胞和肾细胞中的表达量明显上调,而虹鳟鱼干扰素-γ(简称rIFN-y)在这些细胞中的mRNA表达水平也有类似趋势。随后在BL21(DE3)中表达了带有His标签的pET28a-rGILT重组蛋白,并进行了SDS-PAGE和Western Blot鉴定。最后,将人IgG抗体作为底物,我们测定了rGILT的巯基还原酶活性。这些结果表明,rGILT能够还原二硫键,对机体的天然免疫防护有重要作用,同时也为鱼类免疫中GILT的角色提供新的研究依据。 2虹鳟鱼LIGHT的克隆、可溶区表达和组织定量分析本文选择虹鳟鱼作为研究对象,通过RT-PCR的方法从虹鳟鱼的脾脏组织中扩增得到开放阅读框为717bp的LIGHT基因,并对这个基因在不同物种中的同源关系进行了进化分析。通过Real-time PCR的方法对LIGHT基因在不同组织中的分布表达进行了定量分析。通过基因工程手段,构建了pETSUMO-rsLIGHT(虹鳟鱼LIGHT可溶区)重组载体,在体外获得了相应的可溶性蛋白。

关键词：虹鳟鱼 GILT LIGHT 实时荧光定量PCR LPS刺激巯基还原酶活性检测生物信息学分析

人B淋巴细胞刺激因子载体稳定性及其嵌合毒素的表达载体构建与产物性质鉴定

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人B淋巴细胞刺激因子载体稳定性及其嵌合毒素的表达载体构建与产...

作者：吴玉荣南京师范大学

学位级别：硕士

人B淋巴细胞刺激因子(human B Lymphocyte Stimulator,hBlyS)是一种B淋巴细胞的共刺激因子,属TNF超家族成员。BLyS有三个受体BAFF-R,BCMA和TACI,三个受体主要表达于B淋巴细胞。BLyS在Anti-IgM或IL-4存在下能专一的刺激B细胞增殖、分化... 详细信息

人B淋巴细胞刺激因子(human B Lymphocyte Stimulator,hBlyS)是一种B淋巴细胞的共刺激因子,属TNF超家族成员。BLyS有三个受体BAFF-R,BCMA和TACI,三个受体主要表达于B淋巴细胞。BLyS在Anti-IgM或IL-4存在下能专一的刺激B细胞增殖、分化及分泌免疫球蛋白,在体液免疫中有重要的作用。BLyS同自身免疫性疾病有关,在很多的淋巴瘤的发生中有作用。嵌合毒素是具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子。载体主要使用抗体及细胞因子,毒素主要使用超抗原及蛋白质合成抑制剂等。嵌合毒素在肿瘤的治疗上有其突出的优点:对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,细胞毒效价高,无抗药性。本论文详细介绍:本室构建的重组pET30a/hsBLyS质粒在BL21(DE3)菌株中的稳定性观察,嵌合毒素hsBLyS-PE40的基因构建、表达及活性检测。

关键词： B淋巴细胞刺激因子遗传稳定性嵌合毒素杀伤

鲢鱼BAFF和GILT的克隆、体外表达及生物学活性鉴定

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鲢鱼BAFF和GILT的克隆、体外表达及生物学活性鉴定

作者：曹芳南京师范大学

学位级别：硕士

本文利用PCR、原核表达、蛋白纯化、细胞培养、细胞转染、免疫荧光、CCK-8细胞活力检测、激光共聚焦、流式细胞术、Western blot等细胞生物学及分子生物学技术和方法,成功完成了鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)B淋巴细胞刺激因子(ScB... 详细信息

本文利用PCR、原核表达、蛋白纯化、细胞培养、细胞转染、免疫荧光、CCK-8细胞活力检测、激光共聚焦、流式细胞术、Western blot等细胞生物学及分子生物学技术和方法,成功完成了鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)B淋巴细胞刺激因子(ScBAFF)及γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(ScGILT)的克隆、表达和生物学活性的研究。实验结果如下:***的克隆、表达和生物学活性鉴定BAFF是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的重要成员,对B淋巴细胞的成熟、分化及存活具有重要作用。本课题首次从鲢鱼脾脏中克隆得到了 BAFF同源基因鲢鱼BAFF(ScBAFF),结果显示,ScBAFF基因ORF全长804 bp,编码267个氨基酸,其中胞外可溶区包含157个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScBAFF蛋白结构具有跨膜结构域,与其他物种BAFF蛋白类似,是典型的Ⅱ型跨膜蛋白;氨基酸序列比对及蛋白结构预测结果显示,ScBAFF蛋白与其他物种BAFF蛋白同源性较高,空间结构非常相似;组织表达分析显示,ScBAFF主要在鲢鱼免疫器官脾脏及头肾中表达。通过构建融合表达载体,我们成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并用镍柱纯化了重组蛋白His6-ScsBAFF,并进行了 SDS-PAGE及Western blot鉴定。生物活性检测显示,在体外,His6-ScsBAFF蛋白能够与人正常淋巴细胞及人B淋巴瘤细胞Raji表面受体结合,并能促进这两类细胞增殖及存活。这些结果暗示ScBAFF可能在鲢鱼的免疫系统中具有重要的作用,或许能够为鲢鱼免疫系统的研究提供理论依据。***的克隆、表达和生物学活性鉴定GILT对MHC Ⅱ类途径(外源性抗原加工途径)中抗原加工和呈递过程中的二硫键的还原起着重要作用。本实验成功克隆出鲢鱼GILT(ScGILT)全长CDS序列,结果显示,ScGILT基因ORF全长771 bp,编码256个氨基酸,序列分析显示ScGILT氨基酸序列拥有GILT的主要特征,包括CXXC活性基序,CQHGX2ECX2 NX4C序列,糖基化位点NVT以及C端存在6个保守的半胱氨酸残基。组织表达分析显示,GILT的表达具有组织特异性,经LPS刺激后,脾细胞及头肾细胞中ScGILT mRNA的表达量明显上调。我们成功构建了融合表达载体pET28a-ScGILT并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组蛋白His6-ScGILT,对其进行了 SDS-PAGE及Western blot鉴定。生物活性检测显示,His6-ScGILT能够还原人IgG蛋白中的二硫键,具有疏基还原酶活性。最后,通过细胞转染及免疫荧光技术,我们分析了 ScGILT的细胞亚定位,发现经LPS刺激后,ScGILT蛋白与LAMP1蛋白(溶酶体标志性蛋白)在细胞中的定位有很大程度上的重合。以上结果暗示ScGILT可能在鲢鱼对细菌入侵的免疫反应中发挥重要的作用。

关键词：鲢鱼 B细胞刺激因子溶酶体巯基还原酶荧光定量PCR 免疫荧光生物活性

镇痛抗肿瘤肽AGAP对人脑胶质瘤细胞SHG-44增殖和迁移的抑制作用

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镇痛抗肿瘤肽AGAP对人脑胶质瘤细胞SHG-44增殖和迁移的抑制作用

作者：赵有龙南京师范大学

学位级别：硕士

恶性神经胶质瘤是原发性脑肿瘤中最常见的亚型,其具有高度增殖侵袭迁移能力和极大的神经破坏性的特点,被认为是最致命的人类癌症。虽然治疗恶性神经胶质瘤疾病的方法和技术都在不断地改进,但是这种病人治愈的期望值很小。在中国的传统... 详细信息

恶性神经胶质瘤是原发性脑肿瘤中最常见的亚型,其具有高度增殖侵袭迁移能力和极大的神经破坏性的特点,被认为是最致命的人类癌症。虽然治疗恶性神经胶质瘤疾病的方法和技术都在不断地改进,但是这种病人治愈的期望值很小。在中国的传统中医中,东亚钳蝎自宋代以来就已经成为治疗多种疾病必不可少的药物。蝎毒素中含有多种具有不同功能的活性多肽。镇痛抗肿瘤肽AGAP是其中的一种,现已证明其具有明显的抗肿瘤活性。在本实验中,我们用MTT法、流式细胞周期检测和单层伤口愈合实验分别检测了rAGAP对神经胶质瘤细胞系SHG-44增殖、细胞周期和细胞迁移的影响,实验结果显示,重组蛋白rAGAP不仅可以抑制人神经胶质瘤细胞SHG-44和大鼠神经胶质瘤细胞C6的增殖,而且阻断SHG-44细胞周期G1期,并抑制单层伤口愈合实验中SHG-44细胞的迁移。为了解释这些现象,我们进一步研究其作用的机制。本实验分别用western blot、RT-PCR和明胶酶谱分析方法测定了SHG-44细胞中mRNA和蛋白表达量的变化,来研究其抑制SHG-44细胞迁移的作用机制。结果发现：rAGAP可以通过下调p-AKT蛋白的活性来抑制细胞周期调控蛋白CDK2和CDK6的表达,进而抑制RB的磷酸化,阻滞了SHG-44细胞周期G1期向S期的转化。另外,通过研究与细胞增殖迁移相关的信号通路,我们发现rAGAP减少了p-p38, p-c-Jun和p-Erkl/2的活化,下调NF-κB和BCL-2蛋白的表达,从而降低其下游调控目的蛋白VEGF和MMP-9的活性,最终抑制SHG-44细胞的迁移。总之,rAGAP通过阻滞细胞周期G1期和下调Erk1/2的活性来抑制SHG-44细胞增殖,并通过干扰p-AKT, NF-κB, BCL-2和MAPK信号通路蛋白的表达抑制SHG-44的细胞迁移。

关键词：镇痛抗肿瘤肽(AGAP) 人恶性神经胶质瘤细胞(SHG-44) 增殖细胞周期迁移

暗纹东方鲀与荷兰猪LIGHT及其受体HVEM的克隆、表达及功能的研究

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暗纹东方鲀与荷兰猪LIGHT及其受体HVEM的克隆、表达及功能的研究

作者：李春兰南京师范大学

学位级别：硕士

LIGHT是近年来发现的肿瘤坏死因子超家族第14个成员(TNFSF14)。在T细胞的共刺激下,能诱导肿瘤细胞凋亡,并且在自身免疫病、移植物抗宿主病(GVHD)以及抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。本实验室对暗纹东方纯LIGHT的克隆,表达及生物活性进... 详细信息

LIGHT是近年来发现的肿瘤坏死因子超家族第14个成员(TNFSF14)。在T细胞的共刺激下,能诱导肿瘤细胞凋亡,并且在自身免疫病、移植物抗宿主病(GVHD)以及抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。本实验室对暗纹东方纯LIGHT的克隆,表达及生物活性进行了研究。通过RT-PCR法,从暗纹东方纯(Takifugu obscurus)的脾脏组织中扩增得到765bp的mefugu LIGHT基因(简称fLIGHT)。 fLIGHT的开放阅读框(ORF)由254个氨基酸组成,其中胞外可溶段包含153个氨基酸。预测的三维结构显示fLIGHT与人,鼠LIGHT的结构相似。实时荧光定量PCR分析表明,fLIGHT主要在免疫组织中表达。我们在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组可溶性SUMO-fsLIGHT和GFP-fsLIGHT蛋白,并对其进行SDS-PAGE和western blot分析鉴定。激光共聚焦观察显示fsLIGHT可以结合到小鼠淋巴细胞表面。体外MTT检测表明SUMO-fsLIGHT在anti-CD3共刺激下能够促进小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖。本实验的研究结果表明LIGHT在鱼类中是能够强化免疫应答的免疫因子,可以为以后暗纹东方鲀免疫系统的研究提供-定的帮助。另外,我们还对荷兰猪LIGHT及受体HVEM的克隆,表达及生物信息学进行了分析。HVEM作为LIGHT的受体之一,是TNFRF家族的重要一员,在肿瘤免疫,炎症反应,自身免疫性疾病的发生及胸腺阴性选择等过程中发挥重要的生物学作用,鉴于两者对于免疫调节的重要作用,本实验选择实验动物荷兰猪(Cavia porcellus)作为研究对象。通过RT-PCR的方法,从荷兰猪的脾脏组织中分别扩增得到长度为726bp的LIGHT基因和861bp的HVEM基因。进而对这两个基因进行一系列的生物信息学分析,包括扩增的编码基因在基因组中的分布,蛋白三维结构的分析,两个蛋白相互作用的结合位点的预测以及与其他物种的同源关系分析。同时通过Real-time PCR对这两个基因在不同组织中的分布表达进行了分析。本实验还进行了LIGHT蛋白的表达,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了重组可溶性SUMO-gpsLIGHT蛋白,并对其进行SDS-PAGE和western blot分析鉴定。激光共聚焦观察显示gpsLIGHT可以结合到荷兰猪淋巴细胞和小鼠T细胞表面。本次研究对以后进一步研究LIGHT和HVEM提供了基础。

关键词：暗纹东方纯荷兰猪 LIGHT HVEM 荧光定量PCR 激光共聚焦

hsBLyS CHO真核表达及产物的共刺激、凋亡活性研究

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hsBLyS CHO真核表达及产物的共刺激、凋亡活性研究

作者：吴海涛南京师范大学

学位级别：硕士

人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)是1999年发现的肿瘤坏死因子超家族成员。最早发现其可诱导肿瘤细胞凋亡，之后发现它是一个强有力的B细胞共刺激因子，它在体外及转基因动物体内可明显刺激B细胞的生长，免疫球蛋白分泌，并导致动物自身免疫... 详细信息

人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)是1999年发现的肿瘤坏死因子超家族成员。最早发现其可诱导肿瘤细胞凋亡，之后发现它是一个强有力的B细胞共刺激因子，它在体外及转基因动物体内可明显刺激B细胞的生长，免疫球蛋白分泌，并导致动物自身免疫性改变。BLyS的生物功能，作用机制极其复杂，其缺陷或过量表达均能引起机体的免疫失衡，从而诱发多种疾病。BLyS的过度表达是发生自身免疫疾病，特别是系统性红斑狼疮(SLE)的重要因素之一。因此，对BLyS及其受体的研究有助于阐明SLE等自身免疫疾病，BLyS、其可溶性受体和单克隆抗体有望开发为治疗自身免疫综合症的新型药物。 BLyS是高等动物表达的真核蛋白，有N242糖基化位点。故尝试CHO真核分泌表达。本实验通过3’端互补，进行引物延伸合成EPO信号肽序列：信号肽和hsBLyS基因采用重叠延伸拼接法形成融合基因;融合基因分别插入pcDNA3.0、pcDNA3.1、pEFneo真核载体：引物延伸合成信号肽时，利用亮氨酸同义密码，将信号肽基因的倒数第二个密码突变，在重组载体上的信号肽序列之后，形成BlnⅠ酶切位点，使三种载体成为分泌表达载体。磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV-dhfr，共转染入CHO—dhfr细胞;DMEM选择培养液，筛选dhfr阳性细胞克隆;氨甲喋呤浓度梯度增高，加压扩增表达。获稳定表达hsBLyS的细胞株，经MTX加压扩增，表达量由0.1μg/ml上升至2.0μg/ml。 MTT法知hsBLyS表达上清对B淋巴细胞具有共刺激作用;流式细胞仪分析显示只有在共刺激作用下，B细胞才进入S期。 DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪结果显示，hsBLyS表达上清可诱导K562细胞凋亡，且具有剂量依赖效应。

关键词： B淋巴细胞刺激因子 CHO 分泌表达共刺激细胞凋亡