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辣椒疫霉（Phytophthora capsici）10个果胶裂解酶基因克隆及pcpel1的功能研究

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）10个果胶裂解酶基因克隆及pcpe...

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作者：付丽山东农业大学

学位级别：硕士

辣椒疫病是一种在世界范围内的土传病害,也是我国辣椒生产上广泛发生的主要病害之一,近年来由于集约化种植,重茬严重,导致辣椒疫病日趋严重,引起大幅度减产,给辣椒生产带来了极大的危害。辣椒疫病病原是辣椒疫霉菌(Phytophthora capsic... 详细信息

辣椒疫病是一种在世界范围内的土传病害,也是我国辣椒生产上广泛发生的主要病害之一,近年来由于集约化种植,重茬严重,导致辣椒疫病日趋严重,引起大幅度减产,给辣椒生产带来了极大的危害。辣椒疫病病原是辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici),是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,在适宜条件下引起青椒茎腐、根腐和枯萎,寄主范围广,给我国的及世界各国的农业生产造成巨大的经济损失。目前,对于辣椒疫病的防治主要采用化学防治,而培育抗病品种效果不稳定,原因之一是辣椒疫霉具有较强的变异能力。因此,探索辣椒疫霉菌重要的致病因子,研究抗病性生理生化机制,结合抗病性遗传,抗病基因的QTL定位(quantitative trait loci)与基因工程,进行抗病性鉴定和抗病育种方面研究成为病害防治的前景。其中细胞壁降解酶在病害致病关键因子之一,包括角质酶(cutinase),果胶酶(pectinase),纤维素酶(cellulase),半纤维素酶(hemicellulase),蛋白酶(protease)等。而果胶酶又包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果胶甲基酯酶(PME),果胶裂解酶(PL)。果胶裂解酶(PL)是许多植物病原菌分泌的一种果胶酶,能降解植物细胞壁,许多病原真菌,卵菌,细菌在侵染过程都能分泌果胶裂解酶。本文以辣椒疫霉菌为研究对象,克隆了辣椒疫霉果胶裂解酶基因,并进行体外表达研究。以辣椒疫霉强致病和果胶裂解酶活性高的菌株为实验材料构建的DNA文库,借助Pool-PCR技术分离了10个果胶裂解酶基因。对基因结构分析发现10个pel基因具有较高的同源性,并具有不同数目的糖基化位点,所编码的蛋白具果胶裂解酶的保守序列和蛋白活性位点。本研究发现,辣椒疫霉pel基因与其他疫霉pel基因具高度保守序列,也证明了辣椒疫霉菌在自然界中的分类地位。并且对其中一个基因构建质粒进行体外诱导表达,制备了多克隆抗体,借助蛋白印记杂交验证了重组蛋白的免疫活性,利用RT-PCR技术检测了其在发病辣椒叶片内的表达情况,其具体研究结果如下:1、Pool-PCR法筛选基因文库,分离了10个果胶裂解酶基因从GenBank中下载若干pel基因,同源比对设计多对引物,然后进行反复筛选,分离了3个全长和7个非全长基因。将所克隆的10个基因经过Blast搜索,结果显示全部为果胶裂解酶基因。经过DNAman软件处理分析了这10个基因的基本结构,最大开放阅读框长度为1200-1800 bp,编码370-500个氨基酸,预测氨基酸分子量为37-55kDa。利用SignalP 3.0 server和NetNGlyc 1.0 server对这10个基因的信号肽和N糖基化位点进行预测,信号肽长度一般为21-22个氨基酸,N-端糖基化位点以1个的居多,只有pcpel1基因有6个糖基化位点。10个基因的理论PI值差异较大。2、扩增非全长的pcpel基因使用两种方法扩增非全长基因的未知端序列:(1)RACE法:将辣椒疫霉菌置于三角瓶进行振荡培养7天后,收集菌丝。然后液氮研磨,利用Trizol法提取总RNA,经反转录酶作用,合成cDNA,作为模板,以通用引物(USP)和基因特异引物(GSP)进行第一轮PCR;以第一轮产物做模板,用巢式特异引物(NGSP)和巢式通用引物(NUSP)进行第二轮PCR,目的片段回收,连接,转化大肠杆菌DH-5α后,送样测序。将测序片段拼接后,对其进行了初步分析,将两个非全长的基因补充完整,获得了理论全长基因。(2)TAIL-PCR法:将辣椒疫霉菌置于三角瓶进行振荡培养5天后,收集菌丝。然后液氮研磨,利用CTAB法提取总DNA,作为模板,以随即简并引物(AD)和基因特异引物(GSP)进行第一轮热不对称交错PCR;以第一轮产物做模板,用AD引物与第二轮GSP引物进行第二轮PCR,以此类推第三轮,直到得到已知序列的侧翼序列,经电泳检测、PCR产物回收,连接,转化大肠杆菌DH-5α后,送样测序。将测序片段拼接后,对其进行了初步分析,最终将非全长的基因补充完整,获得了4个基因的理论全长序列。3、pcpel1的真核表达根据已经克隆的pcpel1基因序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K/ pcpel1,转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆。重组质粒经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,重组蛋白进行了特异表达,分子量大小约为65kDa。

关键词： Phytophthora capsici 果胶裂解酶基因克隆真核表达 RT-PCR Western Blot

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中国细基格孢属（Ulocladium）和匍柄霉属（Stemphylium）的分类研究

中国细基格孢属（Ulocladium）和匍柄霉属（Stemphylium）的分类...

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作者：王勇山东农业大学

学位级别：硕士

本研究对我国四川、重庆、云南、贵州、湖南、新疆、吉林、辽宁、黑龙江、河北、江苏及山东等12个省、市、自治区以及法国Paris、Angres和Nantes境内的不同地理区域和生态环境的植物病害叶片进行实地采集,共获得标本3500余份。通过室内... 详细信息

本研究对我国四川、重庆、云南、贵州、湖南、新疆、吉林、辽宁、黑龙江、河北、江苏及山东等12个省、市、自治区以及法国Paris、Angres和Nantes境内的不同地理区域和生态环境的植物病害叶片进行实地采集,共获得标本3500余份。通过室内保湿培养和单孢分离共获得细基格孢属(Ulocladium)和匍柄霉属(Stemphylium)两属的真菌菌株138个,经分类研究,描述鉴定新种7个,它们分别是辣椒匍柄霉S. capsici Yong Wang bis & X.G. Zhang、卵圆匍柄霉S. oblongum Yong Wang bis & X.G. Zhang、车前草匍柄霉S. plantaginis Yong Wang bis & X.G. Zhang、桃叶匍柄霉S. pruni Yong Wang bis & X.G. Zhang、槐叶匍柄霉S. sophorae Yong Wang bis & X.G. Zhang和白菜细基格孢U. brassicae Y. Wang bis et X.G. Zhang,拟芹菜细基格孢U. subcucurbitae Y. Wang bis et X.G. Zhang、中国新记录种2个,矛状匍柄霉S. lancipes E.G. Simmons,胡萝卜细基格孢U. dauci E.G. Simmons,除此之外还分离鉴定了国内已报道种10个,链格孢状细基格孢U. alternaria (Cooke) E.G. Simmons,黑细基格孢U. atrum Preuss,葡串细基格孢U. botrytis Preuss,纸细基格孢U. chartarum (Preuss) E.G. Simmons,群生细基格孢U. consortiale (Thüm.) E.G. Simmons,匍柄霉S. botryosum Wallr.,球状匍柄霉S. globuliferum (Vestergren) E. G. Simmons,茄类匍柄霉S. lycopersici (Enjoji) W. Yamamoto,名张匍柄霉S. nabarii M. Sarwar & K.V. Srinath,囊状匍柄霉S. vesicarium (Wallr.) E.G. Simmons。除此之外,通过观察还发现,按照Simmons的观点对细基格孢属的一些种进行形态描述时,7天所产生的次生分生孢子存在不成熟或者个体较少的情况,而当培养到第15天时次生分生孢子的发育已经成熟且形态稳定。并且不同种间的次生孢子的特征存在一定的差异,这些差异性状可以作为种的鉴定依据,进一步完善了本属种级分类标准的内容。我国地域辽阔,植被结构复杂,种菌丰富多样,深入研究肯定能发现这两个属的许多新的分类单位,而且,长期以来,不同的分类学家在研究中所持的分类观点不同,再加上分类体系的变化,给鉴定工作带来很多困难,直接影响这两属分类研究的进展,这些都是亟待深入研究的问题,我们希望通过较系统详尽的研究来加深对这两个属的分类研究,填补该属研究的一些空白,为世界和我国在此领域的发展作出贡献。

关键词：细基格孢属匍柄霉属新种中国新记录种孢子发育

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辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）细胞周期调控蛋白Pcsda1亚细胞定位和RxLR效应因子功能分析

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）细胞周期调控蛋白Pcsda1亚细...

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作者：杨晓燕山东农业大学

学位级别：硕士

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种极具破坏性的丝状植物病原体,其分布广泛,能够引起全世界范围的辣椒疫霉病,对全球农业和自然生态系统具有重要的影响(Fisher et al.,2012)。当前辣椒疫霉主要以施用化学药剂进行防治,但重金属超... 详细信息

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种极具破坏性的丝状植物病原体,其分布广泛,能够引起全世界范围的辣椒疫霉病,对全球农业和自然生态系统具有重要的影响(Fisher et al.,2012)。当前辣椒疫霉主要以施用化学药剂进行防治,但重金属超标、农药残留等问题日益突出,在解决问题的同时,也给辣椒生产、人类生活健康和生态环境安全带来了巨大的威胁和伤害。因此,利用分子生物学技术探索辣椒疫霉菌重要的致病因子及其致病机制越来越成为研究的热点。提高寄主植物的抗病性是控制辣椒疫霉病的最有效的措施。在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的RxLR效应分子,促进和破坏寄主植物的抗病反应。因此,研究RxLR效应分子基因的功能和蛋白结构,对了解辣椒疫霉的致病机制,有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意义。本项研究以本实验室采集并分离保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料,结合相关的研究基础,对辣椒疫霉菌株SD33中的细胞周期调控蛋白Pcsda1和Rx LR效应分子基因进行了如下研究:1、利用生物学软件从JGI辣椒疫霉菌基因组数据库中筛选得到Pcsda1基因和Rx LR效应分子基因核苷酸及氨基酸序列,通过NCBI进行BLASTn及BLASTp比对,确定筛选出的基因的正确性。2、从本实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33中提取的基因组DNA中,克隆Pcsda1基因和Rx LR效应分子基因;3、利用软件对Pcsda1基因和Rx LR效应分子基因进行生物信息学预测和分析。4、将Pcsda1基因融合GFP蛋白在辣椒疫霉SD33中表达,发现Pcsda1基因定位在辣椒疫霉SD33的细胞核中,据此,可以推测目的基因Pcsda1通过影响辣椒疫霉菌细胞核的形成和发育,进而影响菌丝及孢子囊的正常生长发育。5、用鬼笔环肽染色法检测Pcsda1基因沉默转化子、过表达转化子和对照转化子的菌丝和孢子囊时期的肌动蛋白细胞骨架,发现沉默转化子和过表达转化子在菌丝和孢子囊中肌动蛋白的分布不规则,过表达转化子中,肌动蛋白的数量增多,尤其是菌丝中,肌动蛋白变成细长、棍棒状、更加明亮。因此,Pcsda1可以调节肌动蛋白斑块和肌动蛋白丝的分布和形态,尤其是在菌丝中。6、利用pBIN-GFP2表达载体对辣椒疫霉Rx LR效应分子进行功能研究,在本氏烟中表达4个候选效应分子,发现其中129113基因可以诱导本氏烟草发生细胞死亡,129113、101860可以抑制Bax、INF1、CRN4诱导的过敏性坏死反应。7、为了进一步研究RxLR的功能,对4个RxLR效应分子进行亚细胞定位,发现定位在细胞核和细胞质中。将129113基因的C端与核输出信号(NES)和核定位信号(NLS1和NLS2)融合,发现NLS2、NES都改变了129113的定位而NLS1没有改变129113的定位。改变129113的定位,影响了其在寄主植物细胞中的功能。推测129113在植物细胞中起作用有可能发生在细胞质中。通过本研究,我们可以推测4个RxLR效应分子在辣椒疫霉的侵染过程中,可以提高植物的敏感性,或者提高植物的抗病性,为研究辣椒疫霉的侵染机制奠定基础。

关键词：辣椒疫霉 RxLR效应分子过敏性坏死反应肌动蛋白亚细胞定位

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辣椒疫霉菌两个RxLR效应因子（RxLR107和RxLR129）功能初步研究

辣椒疫霉菌两个RxLR效应因子（RxLR107和RxLR129）功能初步研究

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作者：许海青山东农业大学

学位级别：硕士

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）是一种重要的土传植物病原卵菌,能侵染葫芦科和茄科的70余种植物,常引起多种作物的毁灭性病害,给农业生产造成严重损失。辣椒疫霉易侵染多种蔬菜,导致疫病大发生,辣椒疫病发生与流行常给辣椒生产造... 详细信息

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）是一种重要的土传植物病原卵菌,能侵染葫芦科和茄科的70余种植物,常引起多种作物的毁灭性病害,给农业生产造成严重损失。辣椒疫霉易侵染多种蔬菜,导致疫病大发生,辣椒疫病发生与流行常给辣椒生产造成巨大损失。辣椒疫霉菌侵染寄主过程中会分泌多种效应蛋白,包括RxLR,CRN和NLP等,这些效应蛋白具多种功能,能破坏寄主细胞或诱导寄主产生免疫性能。辣椒疫霉基因组中含400余个RxLR效应因子,仅开展了其中的少数RxLR效应因子免疫特性的研究,大多数RxLR效应因子功能特性尚未明确。本论文从辣椒疫霉菌克隆鉴定了2个RxLR效应因子RxLR107和RxLR129,利用基因敲除和沉默技术,开展了RxLR107和RxLR129致病功能特性的研究,取得了有价值的研究结果,具体实验过程和结果如下:1、以实验室保存的辣椒疫霉强致病性标准菌株LT1534为实验材料,分离克隆两个效应分子RxLR107和RxLR129,前期证明RxLR107不引起寄主坏死,但可抑制Bax的功能,而RxLR129可引起叶片坏死,为了进一步探明RxLR107和RxLR129在辣椒疫霉侵染寄主过程的功能特性,本论文借助遗传操作技术分别对这两个基因进行了遗传编辑。2、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对RxLR107基因进行敲除实验,获得若干转化子,对敲除转化子DNA进行提取、PCR扩增以及测序验证得到纯合敲除转化子。通过对基因编辑,发现效应因子RxLR107对寄主致病力变化无影响。3、利用RNA干扰原理技术,沉默RxLR129基因以获得沉默转化子,通过qRT-PCR验证,成功沉默RxLR129效应因子,借助致病性测定技术方法,发现效应因子RxLR129沉默转化子对寄主致病力发生了明显的改变,基因回补之后,致病性恢复,由此证明RxLR129为一关键效应因子。4、RxLR107效应因子不直接参与致病过程,其致病机理将在后期继续深入研究。RxLR129在辣椒疫霉侵染中发挥重要的作用,实验室筛选了RxLR129互作蛋白乙醛脱氢酶,通过验证效应分子与其互作蛋白关系,有望探明RxLR129效应因子的致病分子机理,本研究为后续研究提供了理论依据与技术借鉴。

关键词： CRISPR/Cas9基因编辑技术辣椒疫霉基因沉默 RxLR效应因子

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辣椒疫霉效应分子NLP12晶体结构及功能分析

辣椒疫霉效应分子NLP12晶体结构及功能分析

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作者：黄振岭山东农业大学

学位级别：硕士

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)在侵染寄主植物时,通过分泌NLPs效应分子干扰植物防御,达到入侵的目的。辣椒疫霉引起的疫病对种植业造成经济损失日益增加,当前对于该病防治还是以化学防治为主,广谱性的化学药剂广泛使用也带来了严重的... 详细信息

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)在侵染寄主植物时,通过分泌NLPs效应分子干扰植物防御,达到入侵的目的。辣椒疫霉引起的疫病对种植业造成经济损失日益增加,当前对于该病防治还是以化学防治为主,广谱性的化学药剂广泛使用也带来了严重的生态问题。目前对于胞质外效应分子NLPs致病机制依然存在很多未知等待研究,蛋白结构生物学可以为研究NLPs致病机制、靶点药物的设计等研究提供理论支持。本研究从辣椒疫霉SD33的c DNA扩增出效应分子Pc NLP12,经过原核表达、纯化、结晶解析出Pc NLP12的蛋白结构。通过对蛋白结构分析确定了五个关键氨基酸。利用农杆菌介导的瞬时表达技术对Pc NLP12及五个突变体进行了初步功能检测;同时对突变体进行表达纯化结晶进行蛋白结构解析。主要结果如下:1、从辣椒疫霉SD33中克隆出Pc NLP12,构建NLP12-p ET22b原核表达载体,将目的蛋白与载体C端his-tag融合,经转化诱导目的蛋白能够在大肠杆菌中大量表达。2、经过镍柱亲和层析、阴离子交换层析、分子筛层析,得到了纯度高、性质稳定的融合蛋白。使用Hampton Research公司结晶试剂盒筛选得到高质量的蛋白单晶,经X-ray衍射后收到了一套最高分辨率达1.7(?)的数据,使用分子置换法解析出Pc NLP12的蛋白结构。结构显示Pc NLP12含有一个带负电荷的核心结构域,此结构域由两组反向平行的β-折叠构成核心结构,在核心结构顶端由三个α-螺旋组成相对平整的表面,在底部由三段长短不一的loop构成相对不平整的表面,并且具有柔性的N端区域。3、对Pc NLP12的关键氨基酸位点分别进行定点突变,所有突变体一方面进行原核表达纯化结晶,经过优化已经全部拿到高质量的蛋白单晶,另一方面用瞬时表达技术进行接种实验。4、Pc NLP12菌液可以引起本氏烟叶片坏死而且可能促进INFI的侵染,所有突变体菌液均不能引起本氏烟叶片坏死。5、通过对蛋白结构分析对比筛选到11种与Pc NLP12潜在的互作靶标,为今后工作的开展打下了坚实的基础。本研究解析出NLP12蛋白结构并对其进行了功能以及突变体的研究,为研究辣椒疫霉致病机制、病害防治提供理论支持。

关键词：辣椒疫霉 NLP效应分子原核表达蛋白晶体结构解析

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新西兰匍柄霉（Stemphylium eturmiunum）中与ASF1，STE2和STE3互作蛋白的筛选

新西兰匍柄霉（Stemphylium eturmiunum）中与ASF1，STE2和STE3互...

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作者：姜万年山东农业大学

学位级别：硕士

匍柄霉属(Stemphylium)是丝状子囊真菌中的一类重要真菌类群,在自然界中该属真菌绝大多数以无性态形式存在,但也有一小部分存在有性生殖阶段,而新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)就是其中能产生有性态的种类之一。为了研究新西兰匍... 详细信息

匍柄霉属(Stemphylium)是丝状子囊真菌中的一类重要真菌类群,在自然界中该属真菌绝大多数以无性态形式存在,但也有一小部分存在有性生殖阶段,而新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)就是其中能产生有性态的种类之一。为了研究新西兰匍柄霉(***)与其它匍柄霉属种在有性态进化方面的区别,我们查阅资料发现真菌的有性进化受若干性别相关因子的调控。研究表明,信息素受体基因STE2和STE3在模式菌酿酒酵母、粗糙脉孢菌等菌中都有调控有性发育通路的作用。此外,反沉默因子ASF1对有性发育也有着一定的调控作用。研究表明,△STE2、△STE3和△ASF1单突变菌株在适宜的环境下培养均不能产生有性态。真菌异宗配合发生在两种细胞类型:a和α之间,细胞类型由分泌的信息素控制。两种类型细胞分别能产生两种信息素前体a和α,及两种相应的信息素受体STE2和STE3。在有性生殖过程中,经过加工的信息素α因子被a细胞表面的STE2受体识别,启动交配信号;同样,经过加工的信息素a因子被α细胞表面的STE3受体识别,启动交配信号。为了进一步探索敲除信息素受体基因STE2和STE3后,是否影响其它上下游基因的表达,我们以新西兰匍柄霉(***)为实验材料,主要进行了如下研究:利用Trizol法分别对△STE2和△STE3单突变菌株提取总RNA并进行转录组测序,结果表明敲除信息素受体基因STE2或STE3会影响其上下游一系列基因的正常转录。经过分析与预测,我们从中选取了一系列差异表达比较大的基因,试图筛选信息素受体STE2和STE3的互作蛋白。通过基因序列的比对,我们发现STE2和STE3基因各含有一个内含子。我们通过Over Lap PCR获得了没有内含子的基因序列,并在随后的酵母双杂实验过程中,发现信息素受体STE2和ORF07010(糖苷水解酶家族32蛋白)能够相互作用。反沉默因子ASF1(anti-silencing function 1)在进化上非常保守,而且是组蛋白H3/H4的分子伴侣,在基因转录、DNA复制和修复等多个染色质层面的生物学过程中发挥着重要的作用。通过同源序列比对,我们发现新西兰匍柄霉(***)基因组中含有ASF1基因。根据已报到的ASF1基因的信息,设计特异性引物克隆了新西兰匍柄霉(***)中的反沉默因子ASF1和组蛋白H3、H4的基因。同时利用酵母双杂以及Pull-down实验技术证明,ASF1确实能与组蛋白H4互作,但与组蛋白H3不存在相互作用,这可能与其特定的功能相关。新西兰匍柄霉(***)中信息素受体△STE2和△STE3单缺突变菌株的转录组测序以及反沉默因子Asf1互作蛋白的初步研究,为深入研究新西兰匍柄霉中这三种蛋白的结构与功能打下了良好的基础,为深入探索生物性别起源与分化历程提供了信息积累。

关键词：新西兰匍柄霉酵母双杂交原核表达蛋白提纯

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中国棒孢菌属分类研究

中国棒孢菌属分类研究

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作者：王承海山东农业大学

学位级别：硕士

从我国热带和亚热带地区的广西、广东、云南、海南、福建、江苏、四川等8个省,市,自治区实地采集植物(茎杆、枝条、叶片)标本或土壤标样300余份,对采集的植物标本进行室内保湿培养和土壤标样进行分离培养,获得本属真菌菌株70余株,采用... 详细信息

从我国热带和亚热带地区的广西、广东、云南、海南、福建、江苏、四川等8个省,市,自治区实地采集植物(茎杆、枝条、叶片)标本或土壤标样300余份,对采集的植物标本进行室内保湿培养和土壤标样进行分离培养,获得本属真菌菌株70余株,采用形态学方法鉴定后,得到七个新种,借助文献对这些新种进行了详细描述。七个新种分别是:柚木棒孢菌Corynespora tectonae Ch.H. Wang & X. G. Zhang,甘蔗棒孢菌Corynespora saccharume Ch.H. Wang & X. G. Zhang ,香椿棒孢菌Corynespora toonae Ch.H. Wang & X. G. Zhang,榕棒孢菌Corynespora ficus-altissimae Ch.H. Wang & X. G. Zhang,竹蕉棒孢菌Corynespora donae Ch.H. Wang & X. G. Zhang,金竹棒孢菌Corynespora phylloshureae Ch.H. Wang & X. G. Zhang,棕竹棒孢菌Corynespora rhapis-humilisi *** & X. G. Zhang。通过研究发现,在复杂多变的自然生境条件下,分生孢子形态变异较大,应该以适宜产孢的标准培养条件下的特征作为种的鉴定依据。尤其以分生孢子的大小、长/宽、分隔、喙的有无、颜色、表面饰纹及颜色对该真菌属的种级鉴定极为重要,分生孢子基部细胞的形态特征对种级分类鉴定不可忽视,产胞梗的长短对种级鉴定意义不大。在前人研究基础上,通过深入的分类学研究,发现了本属的七个新种,丰富了该真菌属的研究内容。我国丰富的自然生态条件必然孕育着丰富的真菌资源。如对该属真菌进行更深入地研究,肯定还会发现更多该类群的新种。而且,随着分子生物学技术的发展,为了更好的研究分生孢子形态的变异及属间和属内种间的系统演化关系,可以将传统的经典分类方法与分子生物学技术相结合,以便对该属及近缘属进行更加深入的研究。

关键词：棒孢菌属分类研究新种

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辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）RxLR效应分子筛选及RxLR23的功能研究

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）RxLR效应分子筛选及RxLR23的...

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作者：姜海滨山东农业大学

学位级别：硕士

在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的Rx LR效应分子协同互作来干扰和破坏寄主植物的抗病反应。因此,研究RxLR效应分子基因的功能和蛋白结构,对了解辣椒疫霉的致病机制,有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意义。本项研究以高... 详细信息

在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的Rx LR效应分子协同互作来干扰和破坏寄主植物的抗病反应。因此,研究RxLR效应分子基因的功能和蛋白结构,对了解辣椒疫霉的致病机制,有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意义。本项研究以高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料,结合相关的研究基础,对辣椒疫霉菌株SD33中RxLR效应分子进行研究,实验结果如下:1、根据JGI辣椒疫霉菌基因组数据库中筛选得到Rx LR效应分子基因核苷酸及氨基酸序列,通过NCBI进行序列比对,确定所要筛选的基因序列。从辣椒疫霉菌株SD33中克隆这些Rx LR效应分子并进行生物信息学分析。2、利用pBIN-GFP2表达载体对辣椒疫霉Rx LR效应分子进行功能研究,在本氏烟中瞬时表达4个候选效应分子,发现其中Rx LR23基因可以诱导本氏烟发生细胞死亡,Rx LR129759可以抑制Bax诱导的细胞死亡。3、为了进一步研究RxLR效应分子的功能,分别将4个RxLR效应分子在本氏烟叶片中瞬时表达并用共聚焦显微镜观察各效应分子的亚细胞定位,发现Rx LR23、Rx LR97196、Rx LR129759均定位在细胞核和细胞质中,Rx LR101012定位在细胞核中。4、根据本实验室之前所得到的效应分子Rx LR23的蛋白质三维结构,对其C末端3个保守W结构域进行不同程度的截短,利用pBIN-GFP2表达载体在本氏烟叶片中瞬时表达各Rx LR23截短体,发现3个W结构域对触发ETI的作用无明显区别。5、效应分子RxLR23在辣椒疫霉菌SD33内的基因敲除。为了进一步研究效应分子Rx LR23在辣椒疫霉SD33中的功能,利用CRISPR/Cas9技术对辣椒疫霉SD33内的Rx LR23进行敲除实验,获得效应分子RxLR23的敲除转化子。对效应分子Rx LR23的敲除转化子进行生物学性状分析和致病性测定。结果表明,敲除Rx LR23使得辣椒疫霉致病能力减弱但其对辣椒疫霉的生长及细胞核在菌丝中的分布没有产生明显的影响。通过本研究,我们发现RxLR效应分子功能具有多样性特点,其中包括诱导细胞死亡及抑制Bax诱导的细胞死亡的功能。不同的效应分子定位在寄主细胞内的不同位置发挥作用。Rx LR23 C末端的3个保守W结构域对于触发ETI没有明显的区别。通过对Rx LR23敲除转化子的致病性测定,转化子致病力下降,这表明在侵染过程中,RxLR23具有毒性功能。这为进一步认识效应分子在病菌侵染过程中的作用提供了理论基础。

关键词：辣椒疫霉 RxLR效应分子毒性功能基因敲除致病性测定

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葱叶枯匍柄霉（Stemphylium botryosum）交配型基因MAT1-1、MAT1-2敲除载体的构建及遗传转化系统的建立

葱叶枯匍柄霉（Stemphylium botryosum）交配型基因MAT1-1、MAT1-...

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作者：王琪山东农业大学

学位级别：硕士

匍柄霉（Stemphylium）是丝状真菌中一类重要的真菌类群，在自然界中该属内真菌绝大多数以无性态形式存在，但也有一小部分存在有性生殖阶段。研究发现该属内真菌交配型位点分为三种情况：只有MAT1-1或MAT1-2，或既有MAT1-1又有MAT1-2，... 详细信息

匍柄霉（Stemphylium）是丝状真菌中一类重要的真菌类群，在自然界中该属内真菌绝大多数以无性态形式存在，但也有一小部分存在有性生殖阶段。研究发现该属内真菌交配型位点分为三种情况：只有MAT1-1或MAT1-2，或既有MAT1-1又有MAT1-2，且MAT1-1发生倒置后与MAT1-2连接在一起。其独特的交配型结构为研究真菌有性生殖机制及进化趋势提供了良好的材料。葱叶枯匍柄霉（Stemphylium botryosum）作为该属内的代表种，同一菌株内含有MAT1-1和MAT1-2两个交配型基因，且在实验室条件下易诱导产生有性态。为深入研究交配型基因及其他相关基因的功能，本研究分别构建了这两个基因的敲除载体并对敲除转化体系的建立进行了初步的探索。以从CBS（荷兰）菌种标本馆交换获得的标准菌株S. botryosum (CBS122441)为试验材料，现保存在山东农业大学真菌及真菌资源利用研究室，进行了以下内容研究：1.根据已报道的MAT1-1、MAT1-2基因信息，通过Southern杂交分别检测了野生型菌株内两个基因的拷贝数，确定了其敲除的有效性;2.分别扩增了MAT1-1、MAT1-2两基因的侧翼序列，以pBIG3C28a为基础载体构建了MAT1-1基因敲除载体pBIG3C28a-1R-1L及MAT1-2基因敲除载体pBIG3C28a-2R-2L;3.构建了PEG介导的原生质体转化系统：在原生质体的制备与再生中分析了酶种类及浓度、酶解时间、酶解温度、菌龄以及稳渗剂种类等因素的影响，最终得出15mg/mL裂解酶、10mg/mL溶壁酶、10mg/mL蜗牛酶及5mg/mL纤维素酶四种酶组合用0.7mol/L的NaCl作为稳渗剂在30℃下酶解培养36h的菌丝3.5h可制备出足以用于转化的原生质体，采用1mol/L蔗糖作为稳渗剂再生可得到良好的再生效果，并通过PEG介导转化成功;4.构建了根癌农杆菌介导的遗传转化系统：通过对AS浓度、孢子浓度、农杆菌浓度、共培养时间与温度等不同影响因素的分析得出：用300μmol/L AS诱导OD600值0.8的农杆菌等体积侵染105个/mL的孢子悬浮液，在28℃条件下共培养72h可得到良好的转化效果。葱叶枯匍柄霉交配型基因MAT1-1、MAT1-2敲除载体的构建以及两种遗传转化系统的建立，为深入研究交配型基因打下良好基础，并对其他丝状真菌的遗传转化具有重要的借鉴作用。

关键词：葱叶枯匍柄霉交配型原生质体根癌农杆菌遗传转化系统

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Stemphylium eturmiunum asf1基因敲除突变株的构建及其生物学特性研究

Stemphylium eturmiunum asf1基因敲除突变株的构建及其生物学特...

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作者：熊晨琳山东农业大学

学位级别：硕士

新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)是一种重要的丝状真菌,该种含有交配型基因MAT1-1和MAT1-2,是能够进行有性生殖的少数匍柄霉属真菌之一,这使其成为研究真菌有性繁殖机制和进化的良好材料。asf1(anti-silencing function1)是进化... 详细信息

新西兰匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)是一种重要的丝状真菌,该种含有交配型基因MAT1-1和MAT1-2,是能够进行有性生殖的少数匍柄霉属真菌之一,这使其成为研究真菌有性繁殖机制和进化的良好材料。asf1(anti-silencing function1)是进化上高度保守的组蛋白异二聚体H3/H4的分子伴侣,其参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体的组装与解凝过程,同时也参与基因沉默、转录调控及DNA损伤修复等生物学过程,不同生物中asf1具有功能的保守性与多样性。组蛋白分子伴侣通过影响核小体的结构、稳定性及染色体状态,从而调控基因的表达,影响生物发育。asf1基因在丝状真菌中的研究很少,因此我们对***的asf1基因进行研究,探索其在匍柄霉属真菌发育过程中的作用。本研究选取***(EGS 29-099)为实验材料,该种是同宗配合的丝状子囊真菌,其可在CM培养基、25℃条件下,诱导培养进行有性繁殖,发育特性为产生黑色的子囊壳及成熟的子囊孢子。为了初步探索asf1基因对***生长发育的影响,本研究构建了*** asf1基因的敲除突变株并结合转录组数据寻找表型与内在分子机制之间的联系。主要研究结果如下:成功克隆及鉴定了*** asf1基因,并对其进行了生物信息学分析。构建了asf1基因的敲除载体,获得了asf1基因的敲除突变株(△asf1)。以野生型菌株为对照,对△asf1的生物学特性进行研究发现:△asf1完全不育;△asf1的生长速率远低于野生型的,菌丝分支较多,菌丝融合现象非常普遍;分生孢子由常规的球形或椭圆形变为无规则形状,着生方式由端生变为菌丝间生,并发育为厚垣孢子,分生孢子隔膜数变少,较多团生,单个小孢子变大,产孢梗由菌丝发育而成;△asf1菌丝的细胞核分布不均匀,某些部位较为集中。对两种菌株的转录组进行测序并分析,发现野生型菌丝体(WT)与△asf1差异表达基因为3023个;野生型有性态(SEX)与△asf1差异表达基因为3716个。野生型有性态(SEX)与△asf1、野生型菌丝体(WT)与△asf1、野生型菌丝体(WT)与野生型有性态(SEX)有380个差异表达基因是相同的。通过对以上差异表达基因进行分析,推测190个显著上调或下调表达的基因可能参与了asf1基因调控有性发育途径,并初步界定了10个关键调控基因,说明asf1基因对其它基因的正确转录表达是必需的。综上研究推测asf1基因通过介导组蛋白的组装与解凝对其它基因的表达进行调控,进而对该菌的有性及无性发育产生非常重要的影响。*** asf1基因敲除突变株的获得及其转录组分析,为深入研究匍柄霉属真菌的有性及无性发育提供了理论与经验积累。

关键词：新西兰匍柄霉 asf1基因农杆菌介导的遗传转化转录组有性发育

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