检索结果-南通市图书馆

作者：岳书俭山东农业大学

学位级别：硕士

全基因组关联分析(Genome-wide Association Study;GWAS)是农业动物遗传改良的一个重要方法。本研究采用GeneSeek GGP牛26 K SNP芯片对445头中国荷斯坦牛的产奶性状和体型性状进行了全基因组关联分析,以期找到影响表型性状的重要位点。... 详细信息

全基因组关联分析(Genome-wide Association Study;GWAS)是农业动物遗传改良的一个重要方法。本研究采用GeneSeek GGP牛26 K SNP芯片对445头中国荷斯坦牛的产奶性状和体型性状进行了全基因组关联分析,以期找到影响表型性状的重要位点。研究内容主要有三个方面。1.中国荷斯坦牛群体结构分析利用PLINK(v1.07)软件的主成分分析对中国荷斯坦牛的群体结构进行评估。所有常染色体上的SNPs通过“indep-pairwise”命令获得群体内8705个独立SNP标记,计算个体间的IBS距离,然后通过“mds-plot”命令基于IBS矩阵获得的主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),结果发现不同牛场的群体结构有一些较低的分层现象,但大部分群体混杂在一起。因此,群体结构效应对关联分析结果的影响较小,可以不考虑其影响或把第一、二主成分作为后续关联分析的协变量。2.中国荷斯坦牛产奶性状的全基因组关联分析采用PLINK(v1.07)软件的线性回归模型(Linear Regression Model,LRM)和GCTA(v1.24)软件的混合线性模型(Mixed linear Model,MLM)以牛场场次、胎次、产犊间隔、泌乳周期作为协变量对中国荷斯坦牛的产奶性状进行全基因组关联分析。通过两种模型发现了4个共同的SNPs,与之关联的性状也一致,表明混合线性模型对影响因素的校正相对更严格些。同时距离这些SNPs最近的基因EEF2K、KLHL1和SLC22A8、ATP11B可以分别作为产奶量、持续力和成年当量的候选基因用于后续的基因功能验证与分析。3.中国荷斯坦牛体型性状的全基因组关联分析利用GGP牛26K SNP芯片和两种模型(LRM和MLM)对中国荷斯坦牛体型性状进行全基因组关联分析。采用两种模型对体型性状的关联分析结果差异较大,利用线性回归模型发现了86个显著性SNPs,而采用混合线性模型则只发现了1个显著性位点与胸宽和体躯两个体型性状同时关联。本研究采用两种软件(PLINK和GCTA)的不同模型(LRM和MLM)对中国荷斯坦牛的产奶性状和体型性状进行了全基因关联分析,研究结果发现混合线性模型是一种相对较优的模型。同时我们采用两种不同的模型也发现了一些共同的显著性位点,为下一步基因功能的验证与分析提供了基础。最后,本研究也为山东地区牛群遗传研究的标记辅助选择提供了一些SNPs数据。

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围产期奶牛发生脂肪肝的功能性调节蛋白标记物筛选

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作者：张乐天山东农业大学

学位级别：硕士

脂肪肝是围产期奶牛因为机体能量负平衡所致代谢性疾病,严重威胁产后健康和产奶量,不仅缩短了奶牛的使用寿命,还增加了企业的经济损失。奶牛脂肪肝和人的非酒精性脂肪肝具有相同的特征:肝脏中脂肪的积累。蛋白质组学技术的进步促进了临... 详细信息

脂肪肝是围产期奶牛因为机体能量负平衡所致代谢性疾病,严重威胁产后健康和产奶量,不仅缩短了奶牛的使用寿命,还增加了企业的经济损失。奶牛脂肪肝和人的非酒精性脂肪肝具有相同的特征:肝脏中脂肪的积累。蛋白质组学技术的进步促进了临床上重要的蛋白质生物标志物的发现,近年来的研究显示人的非酒精性脂肪肝的发生过程中很多蛋白质被鉴定出发挥了重要的肝功能代谢调节作用,但在奶牛脂肪肝的发生中还没有明确的研究。前人研究表明,赖氨酸乙酰化修饰在物质代谢和能量代谢中起着重要作用。肝脏,作为一个重要的代谢器官,其参与的大多数代谢过程,都受到了乙酰化的影响。赖氨酸乙酰化修饰在奶牛脂肪肝的发病过程中的研究并不多。本试验在利用血清生化指标进行初步筛选,以及利用肝活检诊断的基础上,收集获得围产期奶牛的正常肝脏（记为Norm,脂肪含量=6.26%±5.23%,n=6）和重度脂肪肝（记为FL,脂肪含量=86.75%±4.83%,n=8）。利用TMT标记技术和高效液相色谱质谱联用技术进行了蛋白质组和乙酰化修饰组分析,分别设置3个生物学重复,从组学水平了解了奶牛围产期发生脂肪肝时肝脏内部发生的生物学变化过程,这为我们深入了解脂肪肝的发病过程提供了契机。本试验采用蛋白质组学与乙酰化组学的联合分析,旨在针对奶牛围产期代谢紊乱造成的脂肪肝高发病率和高淘汰率,筛选出奶牛脂肪肝发生的重要蛋白调控靶点作为其发病的潜在诊断标记和药物靶标,或者预警疾病使奶牛场及时调整饲养方案等提供依据,减少经济损失。结果显示:（1）本研究经过围产期奶牛肝脏组织乙酰化组分析,发现乙酰化差异蛋白中定位于线粒体中的蛋白占总数的36.7%,与线粒体蛋白相关的乙酰化位点占总数的46.6%。其中有74.1%的线粒体蛋白和84.5%定位于线粒体的乙酰化位点发生了显著上调。表明肝细胞线粒体功能受损是发生脂肪肝的一个重要内在原因。其中,线粒体蛋白的乙酰化修饰变化是线粒体功能异常的重要原因,即乙酰化修饰是线粒体功能调节的重要手段。（2）本研究经过围产期奶牛肝脏蛋白质组分析,揭示了与脂肪肝发病机制调控有关的重要途径,其中,发现视黄醇代谢通路在脂肪肝发病过程中受到显著抑制。（3）通过混合样品的蛋白质组学和乙酰化组学联合数据分析筛选,并经过单个样品蛋白质组学数据的验证和二次筛选,我们发现AOX1和ALDH1A1的表达水平与脂肪肝的严重程度呈现出了良好的负相关性,是奶牛脂肪肝发病机制中重要的调控靶蛋白。（4）在乙酰化组分析中,线粒体蛋白HADHA、ACAT1和EHHADH在多个脂质代谢相关通路中的乙酰化水平表现出显著差异,并与其他多个蛋白高度互作,可能是奶牛脂肪肝发生过程中乙酰化修饰的重要调节因子,并可能成为人类NAFLD的治疗靶点。该研究为我们进一步深入理解围产期奶牛的代谢紊乱性疾病提供了重要的理论指导。同时,为我们进一步筛选获得治疗和预警奶牛脂肪肝的发生提供了潜在重要药物靶标,对于未来抗脂肪肝奶牛的育种具有重要的指导价值。

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miR-24-3p与MEN1基因协同调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖及乳蛋白合成

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作者：曹巧巧山东农业大学

学位级别：硕士

研究奶牛乳腺发育,提高奶牛的产奶量及乳品质是奶牛遗传育种工作的重中之重。本实验室前期的研究表明MEN1/menin的表达水平对于奶牛乳腺上皮细胞的增殖、乳蛋白的合成具有重要的调控功能,但调节MEN1/menin表达的上游调节因素目前尚未知... 详细信息

研究奶牛乳腺发育,提高奶牛的产奶量及乳品质是奶牛遗传育种工作的重中之重。本实验室前期的研究表明MEN1/menin的表达水平对于奶牛乳腺上皮细胞的增殖、乳蛋白的合成具有重要的调控功能,但调节MEN1/menin表达的上游调节因素目前尚未知。软件预测bta-miR-24-3p可以与MEN1的3’UTR互作进而调节其表达水平。本研究旨在研究bta-miR-24-3p是否对于MEN1的表达存在调节作用,并解析其在乳腺上皮细胞中的功能。本研究利用脂质体转染技术在细胞水平检测miRNA表达变化对奶牛乳腺上皮细胞的增殖及乳蛋白合成的影响;调控乳蛋白合成的两条重要信号途径是PI3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路,研究miRNA对两条信号通路的调控对研究奶牛乳腺内乳蛋白的合成有重要意义。主要研究结果如下:(1)Target Scan 6.2和RNAhybrid 2.2两种软件筛选出调控MEN1基因表达的bta-miR-24-3p,MAC-T中重组质粒pMIR-REPORT-bMEN1-3’UTR与bta-miR-24-3p mimics/inhibitor进行共转染,发现bta-miR-24-3p能够特异靶向MEN1基因mRNA的3’UTR。(2)瞬时转染bta-miR-24-3p mimics/inhibitor发现二者均在转染后24h表达效果最好,并且能够负向调控MEN1基因的表达;瞬时转染重组质粒pEGFP-C2-bMEN1及siRNA发现MEN1基因能够正向调控bta-miR-24-3p的表达。(3)细胞计数及CCK-8检测细胞增殖,发现bta-miR-24-3p mimics能够促进MAC-T细胞增殖,但bta-miR-24-3p inhibitor无显著影响;流式细胞术检测细胞周期,发现bta-miR-24-3p mimics能够促进MAC-T细胞周期由C/G期向S期进行,qRT-PCR检测细胞周期因子发现CyclinD1、CDK6显著升高(P0.05)。(4)qRT-PCR检测发现,bta-miR-24-3p mimics可在mRNA水平显著降低包括AKT(P<0.01)、mTOR(P<0.01)、4E-BP1(P<0.05)、STAT5(P<0.01)在内的与乳蛋白合成相关基因的表达,并能降低CSNK(P<0.05)的表达。bta-mi R-24-3p inhibitor则表现出相反的调节作用。综上所述,奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中bta-miR-24-3p能够靶向MEN1基因;bta-miR-24-3p能够负向调控MEN1基因的表达,而MEN1基因对bta-miR-24-3p进行正向调控;bta-miR-24-3p能够促进MAC-T细胞增殖,并能促进细胞周期由G/G期向S期进行;此外bta-miR-24-3p可负向调控包括PI3K/AKT/mTOR信号通路及JAK2/STAT5信号通路在内的与乳蛋白合成相关因子的表达,进而负向调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成。

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母源因子Patl2对体细胞重编程的影响

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作者：曹淑媛山东农业大学

学位级别：硕士

自从2006年日本京都大学Shinya Yamanaka实验室发现可以用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子将体细胞诱导为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)以来,体细胞重编程技术已经得到了很大的发展,但仍然存在着效率低、诱导时间... 详细信息

自从2006年日本京都大学Shinya Yamanaka实验室发现可以用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子将体细胞诱导为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)以来,体细胞重编程技术已经得到了很大的发展,但仍然存在着效率低、诱导时间长和安全性差等各种问题。体细胞核移植及早期胚胎发育研究表明,卵母细胞质中特异存在的母源因子启动胚胎的早期发育,激活基因组转录并合成表达新的基因,最后产生级联反应以维持胚胎的持续发育,这些因子可以提高早期胚胎发育及重编程的效率。而存在于雄性原核中的父源性因子也是早期胚胎发育和核移植的重要因素,研究表明在核移植过程中融合一个额外的雄原核可以显著提高核移植胚胎的囊胚率。这些研究进一步证实了卵母细胞质和雄性原核中存在的关键因子可以促进重编程。本研究的目的是筛选出促进重编程的母源或者父源因子,并对产生的iPS细胞系进行鉴定,而后对其促进重编程的机制进行探究。首先,我们根据已报道的早期胚胎蛋白质组数据,筛选了Patl2、Grn、Pdha1、Faf1、Dhodh、Lman1 6个在卵母细胞质及雄性原核中高表达的因子,构建了6个基因的Dox诱导型过表达载体,并以经典的四因子诱导为基础,检测了6个因子对小鼠成纤维细胞(MEF)重编程的影响。我们以Oct4-GFP/Rosa26-M2rtTA转基因小鼠的成纤维细胞为源头细胞进行筛选,结果发现,在6个筛选因子中,过表达母源因子Patl2及Grn、Faf1都可以提高体细胞重编程的诱导效率。其中,又以过表达Patl2对重编程的促进作用最为显著。在重编程结束后收样进行流式检测发现,过表达Patl2产生Oct4-GFP细胞数量与对照组Vector相比高出15倍,多能基因Oct4的表达是细胞完全重编程的标志,说明Patl2的参与让更多的成纤维细胞重编程为具有多能性的诱导多能干细胞。同时碱性磷酸酶染色(AP染色)结果显示的克隆数量也明显增多,过表达Patl2产生的克隆数量是对照组的12倍。并且在重编程过程中Patl2的参与可以加快克隆出现的时间。为了进一步确定Patl2对重编程的作用,在诱导结束后我们挑取单个克隆建立了OSKM+Patl2-iPS细胞系。研究发现,该细胞系具有与胚胎干细胞类似的形态特征,并且由于带有GFP标签的多能基因Oct4的表达而呈现出绿色荧光。接下来,我们在RNA水平上也验证了这一观点,通过对OSKM+Patl2-iPS细胞系多能基因检测发现,多能性基因Oct4、Sox2、Nanog等在所建立的iPS细胞系中高表达,且显著高于源头细胞MEF。这个结果同样在蛋白水平上得到了印证,我们选择了3个多能性的标志蛋白NANOG、SOX2、SSEA1进行了细胞系的免疫荧光染色,选取的OSKM+Patl2-iPS细胞系均呈现红色荧光,证明相应的多能蛋白表达。此外,我们又在分化潜能等方面对细胞系进行了验证。首先对过表达Patl2参与建立的细胞系进行了核型检测,确保核型正常。之后采用悬滴法模拟胚胎环境进行拟胚体(EB)实验,实验证明OSKM+Patl2-iPS细胞系均可在体外分化形成EB,这些EB球在贴壁后,定量检测发现内胚层标志基因Gata6、Sox17,中胚层标志基因Nkx2.5、Brachy,外胚层标志基因Fgf5、Kdr,滋养层标志基因Eomes、Cdx2的表达升高,证明产生的拟胚体可以随机向内胚层、中胚层、外胚层三个胚层分化。在嵌合体实验中,受体胚胎的生殖嵴上可以产生具有Oct4-GFP绿色荧光的OSKM+Patl2-iPSC嵌合,证实了OSKM+Patl2-iPS真正具有全能性。为了探究Patl2促进重编程的具体机制,对重编程第3天、出现克隆(11±2天)及大量出现克隆(15±2天)3个时间点的细胞进行了RNA-seq,测序结果的GO分析显示,过表达Patl2相较于对照组Vector表现出很大的基因差异,其中差异上调基因主要富集在转录、酰胺代谢、肽的合成加工、核糖体、有机氮复合生物合成过程中;差异下调的基因则在泛素蛋白转移酶活性、Ras GTPase结合、磷酸化、细胞粘附性、细胞周期上富集。KEGG通路富集结果显示Patl2过表达主要影响了核糖体及氧化磷酸化,相较于对照组Vector过表达Patl2上调了核糖体组成蛋白编码基因Rpl22、Mrpl34、Rps16等在内的22个基因的表达。总之,我们的研究发现了新的母源因子可以影响重编程。这种在卵母细胞质中高表达的因子——Patl2可以提高重编程的诱导效率,其过表达产生的iPS细胞系可以表达多能性基因,具有正常的小鼠核型,在体外能够向三胚层随机分化并形成嵌合体。并且这些可能是通过Patl2影响转录及代谢来实现的。这些为发掘更高效安全的重编程途径提供了一条新的思路。

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Men1基因调控小鼠肝细胞的脂质代谢和炎症反应

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作者：杜红霞山东农业大学

学位级别：硕士

在奶牛业,脂肪肝的自然发病率普遍较高,给奶牛生产带来很大的经济损失,预防及治疗脂肪肝便成为了育种工作者的目标。有研究表明,menin是调节肝脏脂质代谢的关键因子,可以直接或者与其它因子互作间接的参与肝脏的脂质代谢。Men1(multiple... 详细信息

在奶牛业,脂肪肝的自然发病率普遍较高,给奶牛生产带来很大的经济损失,预防及治疗脂肪肝便成为了育种工作者的目标。有研究表明,menin是调节肝脏脂质代谢的关键因子,可以直接或者与其它因子互作间接的参与肝脏的脂质代谢。Men1(multiple endocrine neoplasia type 1)基因,是多发性内分泌肿瘤1型综合征的关键致病基因,其表达的蛋白便是menin,不仅可以与大量关键转录因子相互作用,也可与大量的细胞内信号通路因子相互作用,广泛参与机体的代谢调节。有研究表明,menin半合子缺失的小鼠表现出体重增加,激素水平增加,如胰岛素和胰高血糖素血清激素水平的增加,肝脏中的甘油三酯增加,脂肪发生变性,同时也表现出代谢相关基因的增加,如解偶联蛋白2(Ucp2),过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(Pgc-1α)和葡萄糖激酶(GK)。本研究拟以Men1基因作为肝脏代谢重要候选基因,研究其在小鼠肝脏代谢过程中发挥的作用,尤其是在脂代谢、糖代谢、胰岛素应答、炎症反应过程中的调控作用。PI3K/Akt、AMPK和NF-κB信号通路是调节糖代谢、脂代谢、炎症反应的重要信号途径,研究Men1基因对其信号通路内因子的调控作用对于研究该基因对奶牛肝脏代谢的调控作用具有重要意义。因此,本研究以小鼠的正常肝脏细胞系NCTC-1469为模型,成功构建了pcDNA3.1-Myc-His-mMen1重组质粒,并瞬时转染使Men1基因过表达;应用RNAi的方法,转染细胞使Men1基因低表达,随后采用qRT-PCR技术,在mRNA水平上检测Men1基因的表达变化,并将RNA样品进行转录组测序,随后用胰岛素、葡萄糖处理小鼠肝细胞,验证并研究Men1对于脂质代谢、炎症反应的调节功能。研究结果表明:(1)构建的pcDNA3.1-Myc-His-mMen1重组质粒在NCTC-1469细胞内成功表达,并发现在转染24h后Men1基因在mRNA水平上的表达量极显著提高(P<0.01);NCTC-1469细胞转染siMEN-2,发现在转染48h后Men1基因mRNA水平上的表达量极显著降低(P<0.01)。(2)提取RNA样品进行转录组测序,Men1过表达导致32个差异表达基因上调,Men1低表达导致157个差异表达的基因变化,其中上调基因为51个(包含5个新基因),下调基因为106个(包含两个新基因),同时通过GO分析和KEGG分析,筛选到胰岛素相关信号通路、糖代谢、脂肪酸代谢通路、炎症通路等,同时还筛选到了一些互作蛋白。(3)在6μg/mL胰岛素、35mmol/L的葡萄糖分别处理8h、48h下,检测发现两者均可下调Men1基因的表达(P<0.01),表明Men1基因参与葡萄糖及胰岛素介导的脂质合成和炎症反应。随后检测转录组测序的数据中筛选的与脂代谢、糖代谢、胰岛素反应、炎症等相关的因子的mRNA水平的表达量,结果显示:添加葡萄糖及胰岛素可上调包括Pgc-1α、Srebp-1c、Fas、Acc1、及Akt在内的与脂质合成相关的基因在mRNA水平的表达。同时降低Ampk、Nf-κb、Il-1b、Tnf-α炎症通路基因的mRNA水平的表达。综上所述,Men1基因可经PI3K/Akt信号通路、AMPK信号通路和NF-κB信号通路调控小鼠肝细胞的脂肪代谢和炎症反应,证明menin是调节肝脏脂质代谢的关键因子,这为进一步研究Men1/menin在其他物种脂肪代谢中的调节功能奠定基础。

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MEN1/menin经PPARγ通路调控脂肪肝脂肪代谢的分子机制解析

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作者：李冉冉山东农业大学

学位级别：硕士

近年来,我国奶业发展迅速,但同时也有许多问题等待解决,奶牛围产期非酒精性脂肪肝病就是影响奶业发展的一个关键问题。患病奶牛容易出现乳房炎,酮病等,而且越高产奶牛患病的几率越大,这对于奶牛的机体健康和奶源质量的把控是个至关重要... 详细信息

近年来,我国奶业发展迅速,但同时也有许多问题等待解决,奶牛围产期非酒精性脂肪肝病就是影响奶业发展的一个关键问题。患病奶牛容易出现乳房炎,酮病等,而且越高产奶牛患病的几率越大,这对于奶牛的机体健康和奶源质量的把控是个至关重要的因素。国内外研究表明,MEN1对与奶牛肝脏TG的积累有着至关重要的作用,MEN1基因是多发性内分泌肿瘤1型综合征（multiple endocrine neoplasia type 1,MEN1）的关键致病基因,其表达产物menin是细胞内重要的转录因子和结构性衔接蛋白,它能够参与细胞内多种生物学过程,调控细胞的代谢。1、为了探究MEN1和其编码的蛋白menin与非酒精性脂肪肝的关系,我们用Q-PCR技术检测了奶牛肝组织中MEN1的m RNA的表达量变化,在奶牛肝脏组织中我们发现患脂肪肝病的奶牛MEN1的m RNA表达量显著（P＜0.05）升高。2、在已知PPARγ通路对脂肪肝发生有作用的前提下,我们检测了奶牛肝组织中,menin与PPARγ蛋白的互作情况和PPARγ下游脂肪肝相关基因的表达水平,结果显示,在奶牛肝组织中menin与PPARγ蛋白存在互作,且PPARγ通路中PPARγ（P＜0.05）、FABP5（P＜0.05）、CPT-1（P＜0.05）显著上调,其他脂代谢基因也有上调趋势。3、为了验证Men1/menin对PPARγ通路下游基因的影响,我们在小鼠的肝细胞中构建Men1过表达、低表达模型,检测发现Men1过表达系统中Fabp3（P＜0.01）、Fabp4（P＜0.05）、Fabp5（P＜0.05）、Cd36（P＜0.05）的表达量显著下调。4、Men1低表达系统中Fabp3（P＜0.05）、Fabp4（P＜0.05）显著高表达,由此得出,Men1对PPARγ通路中Fabp3、Fabp4、Fabp5的表达有抑制作用。5、为探索menin经PPARγ调控FABP3、FABP4、FABP5基因表达的分子机制,我们在奶牛肝组织中Ch IP检测menin与FABP3、FABP4、FABP5的启动子是否结合,结果显示menin可以跟FABP3、FABP4、FABP5基因的启动子相结合,且根据结合量的差异,我们得到在患脂肪肝的奶牛肝组织中menin与之结合量降低。6、在正常小鼠的肝细胞中我们也检测到menin与Fabp3、Fabp4、Fabp5的启动子结合,在Men1过表达、低表达系统中发现,Men1过表达系统相比Men1低表达系统,menin与Fabp3、Fabp4、Fabp5的启动子结合量有上调趋势,这个结果说明menin可以通过与Fabp3、Fabp4、Fabp5基因启动子的结合量的变化来调控基因的转录水平。7、SIRT1作为机体重要的能量调控蛋白,同时也是重要的蛋白去乙酰化修饰酶,我们在奶牛肝组织和小鼠的肝细胞中Co IP检测到menin可以与SIRT1蛋白互作。为了探索menin通过与基因启动子结合来影响其转录的分子机制,我们在小鼠肝细胞中检测SIRT1与PPARγ下游基因Fabp4基因启动子的结合情况,发现SIRT1可以结合到menin与Fabp4启动子结合的同一片段。故我们猜测menin可能同时募集SIRT1和PPARγ进而协同靶向调控靶基因Fabp3、Fabp4、Fabp5的转录水平,以此来调控肝细胞中脂质的沉积。综上,我们发现MEN1基因编码的蛋白menin能够作为媒介蛋白通过与SIRT1蛋白协同作用,经PPARγ蛋白结合到FABP3、FABP4、FABP5基因的启动子上,进一步调控其基因的转录,从而影响肝细胞中脂质的代谢和奶牛肝脏脂肪肝的发生。该研究对于我们揭示围产期奶牛发生脂肪肝的分子病理机制具有开创性意义。同时,该研究为寻找治疗脂肪肝的药物靶标提供重要的理论指导。

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MEN1基因参与调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成

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作者：李洪辉山东农业大学

学位级别：硕士

改善奶牛的泌乳性能,提高奶牛的泌乳产量,一直以来都是奶牛遗传育种工作者的目标。有研究表明,MEN1基因可以通过影响垂体的功能、抑制催乳素启动子活性、催化ERα激活等方面,而对乳腺发育和性能的改善发挥重要的调节功能。MEN1(multiple... 详细信息

改善奶牛的泌乳性能,提高奶牛的泌乳产量,一直以来都是奶牛遗传育种工作者的目标。有研究表明,MEN1基因可以通过影响垂体的功能、抑制催乳素启动子活性、催化ERα激活等方面,而对乳腺发育和性能的改善发挥重要的调节功能。MEN1(multiple endocrine neoplasia type 1)基因,是多发性内分泌肿瘤1型综合征的关键致病基因,其表达的蛋白menin不仅可以与大量关键转录因子相互作用,通过表观遗传方式调控其靶基因的转录和细胞表型,也可与大量的细胞内信号通路因子相互作用,广泛参与机体正常发育和代谢的平衡稳态调节。本研究拟以MEN1基因作为奶牛泌乳重要候选基因,研究其在奶牛乳腺泌乳过程,尤其是在乳蛋白合成过程中的调控作用。PI3K/Akt/mTOR和JAK2-STAT5信号通路作为乳腺中调节乳蛋白合成的重要信号途径,研究MEN1基因对其信号通路内因子的调控作用对于研究该基因对乳蛋白合成的调控具有重要意义。因此,本研究以奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T为模型,构建及瞬时转染重组质粒pEGFP-C2-bMEN1,进行MEN1基因过表达实验;应用RNAi的方法瞬时转染细胞后,进行MEN1基因表达抑制实验。后采用qRT-PCR、Western blot技术,在mRNA水平及蛋白水平检测与乳蛋白合成相关信号通路基因的表达变化,在mRNA水平检测主要酪蛋白之一κ-酪蛋白基因CSNK的表达变化;同时,选取干奶期及泌乳峰期的奶牛乳腺组织,qRT-PCR技术检测不同泌乳时期乳腺组织内MEN1基因及乳蛋白合成相关信号通路基因在mRNA水平的表达关系。通过体外试验和体内验证的联合,寻求MEN1基因的表达对奶牛乳腺内乳蛋白合成的调控关系,从而为奶牛乳腺泌乳调节机制的研究提供一定的理论基础,为遗传改良奶牛乳品质和乳产量奠定理论基础。研究结果表明:(1)构建的重组质粒pEGFP-C2-bMEN1在MAC-T细胞内成功表达,并在转染24h后检测发现MEN1基因在mRNA及蛋白水平的表达量均极显著提高(P0.05)的趋势;而MEN1基因低表达则表现出相反的调节作用。(3)在MEN1基因过表达条件下检测发现,作为主要酪蛋白亚型之一的κ-酪蛋白基因CSNK在mRNA水平表达显著降低(P0.05)、CSNAS1、CSNAS2、CSNK(P0.05)的表达,这与我们在奶牛乳腺上皮细胞中所研究的结果相一致。综上所述,MEN1基因可通过负向调控包括PI3K/Akt/mTOR信号通路及JAK2-STAT5信号通路在内的与乳蛋白合成相关因子的表达,进而参与负向调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成。

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MEN1基因对奶牛乳腺上皮细胞细胞周期调控机制的研究

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作者：刘学山东农业大学

学位级别：硕士

奶牛的产奶量主要取决于乳腺上皮细胞的数量及其分泌活性,增加乳腺上皮细胞的数量对提高产奶量具有重要意义。MEN1编码menin蛋白,在细胞增殖分裂、细胞周期调控以及转录调节、基因组稳定等过程中发挥重要作用。MEN1基因是多发性内分泌肿... 详细信息

奶牛的产奶量主要取决于乳腺上皮细胞的数量及其分泌活性,增加乳腺上皮细胞的数量对提高产奶量具有重要意义。MEN1编码menin蛋白,在细胞增殖分裂、细胞周期调控以及转录调节、基因组稳定等过程中发挥重要作用。MEN1基因是多发性内分泌肿瘤1型综合征的关键致病基因之一,对于特定组织中细胞的异常增殖起到了诱发的作用。另一方面,MEN1对于机体的正常代谢起着重要的调控作用。乳腺是一个重要的代谢器官。本研究拟探讨menin在奶牛的乳腺组织及其乳腺上皮细胞中的功能。研究发现不同生理阶段的奶牛乳腺组织中MEN1/menin表达存在表达变化,进而通过过表达/RNAi干扰技术,发现奶牛乳腺上皮细胞中MEN1/menin表达变化可以改变细胞的生长和增殖。主要研究结果如下：1.利用RT-PCR、WB、免疫组化方法分别检测不同泌乳阶段的奶牛乳腺组织MEN1/Menin的表达变化。menin蛋白阳性点主要位于乳腺腺泡及乳腺导管的上皮细胞中,不同生理阶段的奶牛乳腺组织中MEN1 mRNA水平存在表达变化,menin蛋白各组之间无差异。2.成功建立了真核细胞奶牛Menin蛋白过表达转染体系。利用基因重组技术,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His-bmenl;将重组载体分别转染奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠成肌细胞(C2C12),分别在24h、48h、72h检测目的基因/蛋白的表达,结果表明在3种细胞中转染24h后过表达效果最好,在MAC-T、CHO、C2C12细胞中menin过表达效率分别达到4.41、5.65、1.93倍。3.将真核表达载体转染MAC-T细胞,结果表明转染组MEN1基因表达显著升高(P<0.01),在转染后24h表达量最高,转染组是对照组的27.5倍,menin蛋白的过表达倍数为4.41倍。4.成功建立了真核细胞奶牛Menin蛋白限量表达体系。将siRNA转染进MAC-T细胞中,结果表明转染sibMEN-1/2/324h后,MEN1基因在mRNA和蛋白表达水平相比对照组均最低并达到极显著(P<0.01),干扰效率分别为75%、71%。5.在过量/限量表达menin的条件下,利用CCK-8、流式细胞术和qRT-PCR技术,从不同角度都证明menin可以调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖以及细胞周期。menin过表达对细胞增殖及细胞周期没有显著影响;menin限量表达能显著提高G1期细胞百分比,降低S期百分比(P<0.05),CyclinD3、CyclinB2、CDK6基因的表达显著升高,CyclinD1的表达显著降低(P<0.05)。

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中国荷斯坦牛不同泌乳阶段乳腺基因差异表达研究

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作者：赵萌山东农业大学

学位级别：硕士

泌乳曲线变化的内在分子机理长期以来一直是困扰泌乳生物学家的难题,泌乳高峰过后产奶量下降是造成奶农经济损失的重要原因。为了探究中国荷斯坦牛泌乳启动、泌乳退化、泌乳上升、泌乳下降过程乳腺内部分子控制机制及乳腺发育和泌乳更... 详细信息

泌乳曲线变化的内在分子机理长期以来一直是困扰泌乳生物学家的难题,泌乳高峰过后产奶量下降是造成奶农经济损失的重要原因。为了探究中国荷斯坦牛泌乳启动、泌乳退化、泌乳上升、泌乳下降过程乳腺内部分子控制机制及乳腺发育和泌乳更替的机理,本研究采取了处于泌乳早期、泌乳高峰期、泌乳中期、泌乳后期和干奶期五个泌乳阶段空怀奶牛的乳腺组织进行转录组测序。转录组测序技术能够对真核生物进行全面而复杂的分析,具有误差少、动态范围广、假阳性信号率低、重复率高的特点,已经成为一种全面而准确的基因表达模式的分析工具。本研究总共获得37.98Gb的reads,其中有86.34%-88.24%的数据能够单一比对到参考基因组。通过对不同泌乳阶段乳腺转录组进行比较,筛选出差异表达基因,并应用GO富集分析、KEGG通路分析、QTL分析、蛋白互作网络分析等方法对其进行联合分析,应用荧光定量PCR和免疫组化技术对分析结果进行验证。分析结果显示,(1)泌乳启动和泌乳退化过程差异表达基因大都与物质代谢与转运活动及免疫反应相关;泌乳高峰前后与细胞外基质相关的基因表达发生显著变化。(2)筛选出23个与泌乳相关的候选基因。(3)随机选取18个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,RNA测序结果与荧光定量PCR结果呈现高相关(R=0.866)。(4)对4个泌乳功能蛋白进行免疫组化验证,发现这4个蛋白在乳腺上皮细胞内表达,且蛋白表达水平与mRNA水平呈现正相关。综上所述,泌乳曲线变化暗藏乳腺泌乳的自我调控机制。其一,在泌乳启动和退化过程中乳腺内部活动呈现相似的变化,但调节方向相反。其二,细胞外基质重塑充斥着泌乳高峰期前后乳腺内部的变化,但调节方向也是相反的。本研究的发现将为寻找新的提高泌乳量的方法提供理论基础。

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奶牛分子系谱鉴定的微卫星标记筛选及其与生产性能的关联分析

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作者：殷彬山东农业大学

学位级别：硕士

奶牛个体系谱错误或丢失会导致近交衰退和遗传多样性减弱,延缓奶牛遗传进展,对奶牛选种选配和遗传改良工作造成重大影响。为优化前人研究的微卫星位点亲子鉴定技术,尝试使之能有效的应用于奶牛群体亲子鉴定与系谱构建,本研究从ISAG中初... 详细信息

奶牛个体系谱错误或丢失会导致近交衰退和遗传多样性减弱,延缓奶牛遗传进展,对奶牛选种选配和遗传改良工作造成重大影响。为优化前人研究的微卫星位点亲子鉴定技术,尝试使之能有效的应用于奶牛群体亲子鉴定与系谱构建,本研究从ISAG中初步筛选了18个微卫星位点,从佳宝一牧奶牛场采集300头荷斯坦奶牛血液及毛囊样品,9头种公牛冻精样品,经琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,筛选了8个微卫星位点（TGLA122、TGLA227、BMC1207、INRA134、INRA037、BM103、MB026和BP7）用于荷斯坦奶牛亲子鉴定。运用Cervus3.0软件对个体进行微卫星基因型的检测,计算了8个微卫星位点的等位基因数（nA）、等位基因频率、多态性信息含量（PIC）、群体观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）,并做了Hardy-Weinberg平衡检测,微卫星位点单个位点排除概率（PE）,多个位点结合排除概率（CPE）,运用SAS 8.2中的GLM程序对6个生产性状和8个位点进行单位点线性分析,得到如下结果:（1）8个微卫星位点多态性各异,等位基因数在7～19个之间,平均等位基因数为14.63。其中微卫星位点TGLA227、TGLA122和INRA134有19个等位基因,位点BMC1207有18个等位基因,均表现出很高的多态性;微卫星位点BP7有7个等位基因,在8个位点中多态性最低。（2）8个微卫星位点的多态信息含量（PIC）和期望杂合度（He）较高,8个位点的多态信息含量在0.520（BM103）.866（TGLA227）之间,平均为0.747。PIC值大于0.5则为高多态性位点,由此可见8个位点均为高多态性位点。8个微卫星位点的期望杂合度（He）在0.553（MB026）.880（TGLA227）之间,平均期望杂合度为0.718,进一步说明8个位点具有较高的多态性。（3）8个位点的单亲排除概率从0.181（MB026）到0.601（TGLA227）之间变化,其中大于0.5的位点有TGLA227、TGLA122和BMC1207,在双亲未知的情况下,8个微卫星位点的结合排除概率达到99%,在一个亲本基因型已知的情况下,8个微卫星位点的结合排除概率大于99%,因此初步确定微卫星位点TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026可用于中国荷斯坦奶牛的亲权鉴定体系。（4）通过对6个生产性状和8个位点进行单位点线性分析得出,微卫星位点BP7对乳蛋白量具有显著影响（P<0.05）,对乳脂量具有极显著影响（P<0.01）;微卫星位点INRA134对乳脂量和乳蛋白量均有显著影响（P<0.05）;微卫星位点BM103对乳脂率具有显著影响（P<0.05）。

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