检索结果-南通市图书馆

作者：徐晓杰南京农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪的一种重要的病原,给全球养猪业造成重大的经济损失,临床上主要是以母猪流产、早产、木乃伊胎以及死胎等,仔猪和育肥阶段的猪发生呼吸道疾病为特征。GP5是一个主要的膜蛋白,包含大约200个氨基酸。它... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪的一种重要的病原,给全球养猪业造成重大的经济损失,临床上主要是以母猪流产、早产、木乃伊胎以及死胎等,仔猪和育肥阶段的猪发生呼吸道疾病为特征。GP5是一个主要的膜蛋白,包含大约200个氨基酸。它有氨基酸信号肽、糖基化位点和可以诱导中和抗体的抗原决簇。由于它的免疫学意义和多态性,GP5已经用于分析PRRSV基因的多样性。而NSP2有多个B细胞表位,具有较强的免疫原性,能够刺激机体产生特异性抗体。本研究于2015-2016年对我国12省市流行毒株进行了 GP5基因测序分析,并采用PCR方法将NSP2基因克隆至原核表达载体中进行表达,制备获得1株NSP2单克隆抗体。具体内容如下:1.2015-2016年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学调查采集2015-2016年我国江苏、浙江、四川、安徽、山东、河北、河南、上海、广东、广西、福建、江西等12省市362份临床发病猪的肺脏病料,用RT-PCR检测RRRSV,结果191份为阳性,阳性率为52.8%。34株PRRSV毒株ORF5长度均为603bp,同源性为88.9%-99.4%。基因进化树分析结果显示,34株PRRSV毒株均是美洲型,分为4个基因亚型,其中2个毒株与VR2332属于亚型Ⅱ,6个毒株和MN184C毒株属于亚型Ⅲ,2个毒株属于亚型Ⅳ,其余毒株属于亚型Ⅰ,证明我国PRRSV存在遗传多样性,为该病防控提供了理论依据。2.猪猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白原核表达与单克隆抗体研制采用PCR方法从重组质粒pCMV-TJM中分段扩增获得Nsp2四个基因片段,分别克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌BL21中表达获得4种重组蛋白NSP2-1、NSP2-2、NSP2-3和NSP2-4,大小约为65kDa。Western blot结果显示,重组的四种重组蛋白均能被HIS单抗识别。用纯化的重组NSP2蛋白,免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备获得1株抗NSP2单克隆抗体5D2,亚型为IgG1型,其轻链为κ链。细胞培养上清液ELISA效价为1:160,将细胞连续传代20次,抗体效价基本一致。间接免疫荧光表明5D2与PRRSV的S1和TJM株产生特异性反应,而不能与BB0907和FJ1402毒株反应,为NSP2功能研究奠定了基础。

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EHEC O157：H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护及人工感染牛羊试验

EHEC O157：H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护及人工感染...

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作者：赵攀登南京农业大学

学位级别：硕士

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC) O157:H7是一种重要的动物源性致病菌,易引起婴幼儿及老人腹泻、出血性结肠炎(HC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)及溶血性尿毒综合征(HUS)等严重并发症,部分HUS病例可... 详细信息

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC) O157:H7是一种重要的动物源性致病菌,易引起婴幼儿及老人腹泻、出血性结肠炎(HC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)及溶血性尿毒综合征(HUS)等严重并发症,部分HUS病例可致死亡。该菌长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中,牛是其主要的贮存宿主,造成幼龄动物腹泻,并污染畜禽产品及水源和农作物等,给农牧业带来巨大的损失,也对人们的健康构成巨大威胁。自首次于美国发现因该菌引起的食物中毒以来,疫情不断扩散蔓延,在多个国家相继引起暴发流行,我国于2000年也发生暴发流行,危害程度可能是迄今为止最严重的一次。目前还没有理想的疫苗能够防治该菌引起的感染。研制能够减少宿主动物排菌的疫苗,以减少传染源对人类健康的威胁是该领域的主要研究方向。 1. O157:H7pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒的构建和融合蛋白的表达采用PCR方法获得目的基因tir-tccp,构建pCold Ⅰ-tir-tccp重组质粒。转化*** BL21(DE3)后IPTG诱导,超声破菌后SDS-PAGE检测目的蛋白主要存在于上清,表明Tir-Tccp蛋白以可溶形式表达。Western blot鉴定目的蛋白具有良好的反应原性。 2.肠出血性大肠杆菌O157:H7Intimin和Tir-Tccp蛋白对小鼠免疫保护性研究研究不同浓度的O157:H7Intimin和Tir-Tccp蛋白对接受1×1010CFU O157:H7小鼠的免疫保护作用。将Intimin和Tir-Tccp蛋白和佐剂充分乳化后,通过背部和腹部皮肤皮下多点注射的方式免疫小鼠,对照组注射等量的PBS。共免疫两次,间隔14d,末次免疫后的14d攻毒O157:H71×1010CFU/只。在每次免疫后的14d通过断尾采血,用间接ELISA检测血清抗体。攻毒后,观察小鼠精神状态,记录死亡数并检测排菌。ELISA结果表明,Tir-Tccp蛋白诱导小鼠产生IgG抗体水平明显升高,而Intimin诱导产生的IgG抗体升高不明显。攻毒后,两个免疫组小鼠均死亡1只,存活14只,存活率为93.3%;对照组小鼠死亡4只,存活6只,存活率为60%。免疫组在攻毒后6d,粪便中检测不到0157：H7;而对照组在攻毒后13d仍有较高的排菌量。本实验表明紧密素和Tir-Tccp蛋白对小鼠起到了有效的免疫保护性作用,能够减少0157：H7在小鼠体内的定植。 3.肠出血性大肠杆菌0157：H7感染牛羊试验以1×1010CFU/只EHEC O157:H7的剂量通过灌胃方式攻毒动物,检测牛、羊的粪便排菌量和排菌时间。攻毒前,所有动物饮用5g/L的链霉素溶液3d,目的是增强0157：H7在肠道内的定植。攻毒前所有动物禁水、禁食12h,攻毒后12h恢复饮水、饮食。攻毒后给予所有动物0.5g/L的链霉素溶液。攻毒后的24h开始检测粪便的排菌量。结果显示,牛最长排菌时间为17d,最高排菌量达5×105CFU;羊最长排菌时间达13d,最高排菌量为1×10SCFU。本实验对EHEC O157:H7主要宿主的排菌时间和粪便排菌量做了初步研究,为探索EHEC O157:H7感染宿主机制和用于疫苗效力评价及动物模型的建立奠定了基础。

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欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达与单克隆抗体的研制

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达与单克隆...

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作者：王晓丰南京农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美国首次被发现,临床主要表现为怀孕母猪的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道疾病。病原PRRSV属尼多病毒目动脉炎病毒科,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒.P... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美国首次被发现,临床主要表现为怀孕母猪的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道疾病。病原PRRSV属尼多病毒目动脉炎病毒科,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒.PRRSV基因组大小约为15kb,含有9个开放阅读框(ORFs),其中ORF7编码的核衣壳蛋白(N蛋白)作为病毒粒子中含量最高、免疫原性最强的结构蛋白之一,对于PRRS的诊断及监控防治具有重要意义。本研究选取欧洲型PRRSV SS-6毒株为研究对象,在克隆并鉴定该病毒N蛋白基因的基础上,进行N蛋白的原核表达,并利用表达的重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,为建立有效的欧洲型PRRSV检测方法以及N蛋白结构和功能研究奠定基础。 1.欧洲型PRRSV N蛋白基因的克隆及原核表达根据GenBank中欧洲型PRRSV标准毒株(LV)ORF7基因序列设计了3条引物,且在其中两条引物上分别设计了EcoRI和XhoI酶切位点,以此引物扩增PRRSV SS-6毒株的N蛋白基因。将获得的PCR产物用EcoR I和Xho I酶切后与经同样处理的pGEX-6p-1原核表达载体进行连接,转化DH5α细胞后挑取阳性克隆。经酶切鉴定和测序验证后,将重组质粒pGEX-N转化至E. coli BL-21中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,重组N蛋白分子量大小约为40kDa。免疫印迹试验结果显示,以融合表达的重组N蛋白免疫小鼠制备的抗血清能够与超速离心纯化的欧洲型PRRSV发生特异性反应,证明所表达的蛋白具有PRRSV抗原性. 2.欧洲型PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备取纯化的重组GST-N蛋白免疫6～8周龄Balb／c小鼠,分离其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆,经过3次亚克隆获得1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为1B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgGl型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：640,腹水的效价为1：256000。本研究为欧洲型PRRSV N蛋白结构和功能研究提供了有用工具。

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猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立及猪鼻支原体单克隆抗体的鉴定

猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立及猪鼻支原体单克隆抗...

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作者：田瑞雨南京农业大学

学位级别：硕士

近年来,随着猪场恶性传染病的逐步控制,以支原体为代表的慢性呼吸道传染病成为疫病控制的焦点。本研究围绕猪肺炎支原体和猪鼻支原体的检测方法及工具开展相关研究。(1)猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是一种高发病率、低... 详细信息

近年来,随着猪场恶性传染病的逐步控制,以支原体为代表的慢性呼吸道传染病成为疫病控制的焦点。本研究围绕猪肺炎支原体和猪鼻支原体的检测方法及工具开展相关研究。(1)猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道疾病-猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)的病原。该病容易引起其他病原继发感染,引发猪呼吸道疾病综合征。目前,我国主要使用灭活疫苗防控MPS。灭活疫苗中抗原含量是决定猪支原体肺炎疫苗质量和免疫效力的关键之一。本试验拟建立一种灭活疫苗体外效力检测方法,以期成为动物试验的替代方法用于MPS灭活疫苗的效力检验。研究中,以P46蛋白为基础建立了双抗体夹心ELISA方法并对其反应条件进行优化,应用该方法对培养抗原和成品疫苗进行了定量检测,并与传统检测方法进行对比,证明该ELISA可作为疫苗生产中Mhp定量的可靠方法使用。(2)猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)普遍存在于猪的鼻腔、气管和支气管分泌物中,可引起多发性浆膜炎、肺炎、关节炎及中耳炎等临床症状,导致猪生长性能下降,并可与多种呼吸道病原混合感染,加重病情。Mhr临床猪场感染率高、适应力强,极难净化,近年来临床关注度日渐增加。同时Mhr与多种人类肿瘤相关,属于人兽共患病原。但目前,Mhr的诊断技术尚不完善,其感染机制研究尚处于起步阶段。本试验对制备的一株猪鼻支原体的单克隆抗体进行了全面鉴定,为Mhr的致病机理及病原诊断研究提供重要试验工具。本研究主要从以下几个方面开展:1、Mhp抗原定量ELISA检测方法的建立及其用于抗原培养物检测研究。以抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体为包被抗体,抗P46蛋白多克隆抗体为检测抗体建立了猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA方法。优化其反应条件为:抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体包被浓度为2.5μg/mL,抗P46蛋白多抗及酶标二抗稀释倍数分别为1:40 000和1:10 000。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检出量为9.754 ng/mL,与猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等无交叉反应。使用该ELISA方法对人工稀释的培养物中抗原含量进行检测,通过单点法和对样品倍比稀释后进行双平行线拟合两种方法计算,得出两种计算方法结果均与真实值基本相符,但双平行线法检测比单点法检测更加稳定。使用该方法检测的猪肺炎支原体菌液抗原含量与颜色单位改变法(color changing units,CCU)检测结果基本相符。2、Mhp抗原定量ELISA检测方法用于成品疫苗检测研究。采用低温冻融法、95%乙醇法、三氯甲烷法、正丁醇法及丙酮法几种破乳方法,通过夹心ELISA方法对猪肺炎支原体油包水型灭活疫苗中的抗原含量进行测定,并对测定结果进行比较,从而筛选出适合猪肺炎支原体油包水型灭活疫苗中抗原含量测定的方法,并与兔免疫抗体检测法进行了对比,探索了该方法作为疫苗效力检验替代方法的可行性。实验结果表明,丙酮法用于处理肺炎支原体油包水型灭活疫苗效果较好,与其他方法相比,该方法提取效率高,消耗低,破乳剂对有效抗原干扰较小。利用该方法处理成品疫苗后进行夹心ELISA检测,可准确检测出不同效价成品疫苗中的抗原含量差异。3、一株猪鼻支原体单克隆抗体的制备与鉴定。将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,鉴定其抗体亚型,测定纯化单抗的效价、特异性,并将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间接免疫荧光试验。获得了 1株猪鼻支原体单抗,命名为Mhr-08。该单抗的亚型属于IgG1,轻链为κ型。ELISA测定该纯化单抗效价为1:102 400,Western-blot检测结果表明,该单抗与猪鼻支原体全菌蛋白在43kDa处出现特异性反应条带,与其他支原体、大肠杆菌及KM2培养基无交叉反应;该单抗为猪鼻支原体表面膜蛋白抗体,可成功应用于菌落免疫杂交试验;将其用于间接免疫荧光试验可成功检测出黏附于猪气管上皮细胞上的猪鼻支原体,该特异性单抗的获得为猪鼻支原体的诊断技术及致病机理的研究提供了工具。综上所述,本研究建立了一种双抗体夹心ELISA方法可用于Mhp培养物及灭活疫苗的Mhp抗原定量检测,为Mhp灭活疫苗生产及效力检验提供了参考方法;同时,本研究对所制备的一株猪鼻支原体单克隆抗体进行了鉴定,证明其为一种特异性针对Mhr表面膜脂蛋白的单抗,为猪鼻支原体致病机理、病原检测的研究提供了重要工具。

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猪肺炎支原体P46蛋白与DnaK蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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作者：缪芬芳南京农业大学

学位级别：硕士

猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性呼吸道疾病,其主要临床症状为咳嗽和气喘,病变特征是在肺尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样或虾肉样实变,该病发病... 详细信息

猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性呼吸道疾病,其主要临床症状为咳嗽和气喘,病变特征是在肺尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样或虾肉样实变,该病发病率高而死亡率低。本研究利用Mhp 168株F350代全菌蛋白免疫小鼠,以期获得能稳定分泌针对Mhp细胞膜蛋白P46蛋白、热休克蛋白DnaK蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。1.抗Mhp膜蛋白P46蛋白单克隆抗体本研究利用本实验室保存的Mhp P46蛋白重组阳性质粒大量表达并纯化的P.46蛋白作为检测原,Mhp168株F350代全茵蛋白作为免疫原,按400μg/只的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,经皮下多点注射免疫4-6周龄BALB/c小鼠。每隔2周用弗氏不完全佐剂乳化的168全菌蛋白免疫1次,并在融合前3d用168全菌蛋白加强免疫1次。取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,利用P46蛋白、Mhp168全菌蛋白、空载体蛋白筛选能分泌P46蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了1株能稳定分泌抗P46蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为*** Blot分析显示,2F3能与Mhp168株F350代全菌蛋白及大肠杆菌表达的P46重组蛋白产生反应,与空载体蛋白、猪鼻支原体(mycoplasma hyorhinitis)蛋白不产生反应。2F3与Mhp 168株F105代强毒株、J株、Mhp临床分离株XLW-1、XLW-2、XLW-4、AH、XLW-4、WX有特异性反应。亚型鉴定显示,该抗体的重链为IgG2b型,轻链为K链。采用间接ELISA测得2F3细胞上清与P46蛋白的反应效价为1：1600,与168全菌蛋白的反应效价为1：160;腹水与P46蛋白的反应效价为1：204800,与168全菌蛋白的反应效价为1：51200,腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后及冻干后抗体效价均为1：51200。2.抗Mhp热休克蛋白DnaK蛋白单克隆抗体本研究利用本实验室保存的猪肺炎支原体DnaK蛋白重组阳性质粒大量表达及纯化DnaK蛋白。利用超声破碎获得的168株F350代全菌蛋白作为免疫原免疫小鼠,免疫剂量为400gg/-。应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,用DnaK蛋白、168全菌蛋白、空载体蛋白三者筛选能分泌DnaK蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了3株能稳定分泌DnaK蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2、5D10、3A8。Western Blot分析显示,3E2、3A8及5D10能与Mhp全菌蛋白及大肠杆菌表达的DnaK重组蛋白产生反应,与空载体蛋白不反应,3E2及5D10与猪鼻支原体无反应,而3A8与猪鼻支原体产生反应。3E2、5D10与Mhp168株F105代强毒株、J株、Mhp临盏床分离株XLW-1、XLW-2、XLW-4、AH、XLW-4、WX有特异性反应。亚型鉴定结果显示,3株杂交瘤细胞的重链均为IgG1型,轻链菌为K链。采用间接ELISA测得3E2、5D10、3A8细胞上清与DnaK蛋白的反应效价为1：51200-1：102400,与168全菌蛋白的反应效价均为1：640-1：1280;3株单抗腹水与DnaK蛋白及168全菌蛋白反应的效价均为1：106,腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后效价仍为1：106。综上所述,本研究共获得了1株分泌Mhp P46蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株分泌Mhp DnaK蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,从而为进一步Mhp致病机理的研究,Mhp P46蛋白及DnaK蛋白抗原表位的确定,以及Mhp血清学诊断方法的建立奠定基础。

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猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗的研制与免疫效力研究

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作者：徐蓉南京农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus, PCV2)是造成断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原,而副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPs)是Glasser’s病的病原菌,二者常混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。免疫预防是控制这两种疾病的主... 详细信息

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus, PCV2)是造成断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原,而副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPs)是Glasser’s病的病原菌,二者常混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。免疫预防是控制这两种疾病的主要手段之一。目前均有商品化灭活疫苗使用,但猪圆环病毒、副猪嗜血杆菌二联灭活苗尚未见报道。国内外研究证明,PCV2ORF2编码的结构蛋白(Cap),可以诱导机体产生较高水平的抗体,对机体具有很好的免疫保护作用。本课题基于实验室已成功构建并获得的重组杆状病毒表达PCV2Cap蛋白(BCap).将副猪嗜血杆茵血清5型(HPs5)灭活茵液,分别与BCap蛋白、PCV2灭活病毒液混合制备成二联苗,接种PCV2、HPs阴性断奶仔猪,研究其对免疫接种猪的安全性与免疫保护力。具体研究内容如下：将BCap (4mg/mL)和PCV2灭活病毒液(1O5.0TCID50/mL),分别与HPs5灭活抗原(5×109CFU/mL)混合,与GEL佐剂配制成二联灭活疫苗。将35头28日龄的健康仔猪随机分为4组：BCap/HPS5免疫组(10头)、iPCV2/HPs5免疫组(10头)、攻毒对照组(10头)、空白对照组(5头)。免疫组分别肌肉注射上述制备的两种疫苗。免疫后4周分别用HPs5(2×109CFU/mL)、PCV2SH株(105.0TCID50/mL)攻毒,隔离饲养观察,分别于攻毒后14天、28天剖杀。免疫后定期采血检测ELISA抗体水平。通过ELISA抗体、攻毒后临床表现及体温变化、相对日增重、病毒血症、解剖时病理变化及显微病变等指标评价疫苗效果。结果为：①免疫后28天,所有免疫猪均产生了针对HPs或PCV2的抗体;②PCV2和PRRSV攻毒后,攻毒对照组猪平均体温高于免疫组,免疫组猪仅出现短时间的发热,无明显临床症状;各组猪平均体重均升高,两免疫组相对日增重高于攻毒对照组但与空白对照相似(P>0.05);攻毒后14天,攻毒对照组猪血清的病毒血症明显高于两免疫组(P0.05);两免疫组在剖检病理变化和病理组织学变化方面相似,但明显轻于攻毒组对照组。本研究表明,BCap/HPs5与iPCV2/HPs5二联苗免疫猪体后均能诱导机体产生免疫应答,并在一定程度上能够抵抗PCV2与HPs对猪体的感染,对猪体有一定的免疫保护作用。

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依恋理论视角下改善二孩家庭消极同胞关系的个案工作实务研究

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作者：代莉西华大学

学位级别：硕士

2016年1月1日起,“全面二孩”生育政策在全国正式实施。这一政策的实施不仅影响到社会的方方面面,也极大地影响着承担生育任务的家庭,尤其是与日俱增的“二孩”家庭。随着“二孩”的降生,家庭结构发生变化,部分“大孩”无法适应身份转变... 详细信息

2016年1月1日起,“全面二孩”生育政策在全国正式实施。这一政策的实施不仅影响到社会的方方面面,也极大地影响着承担生育任务的家庭,尤其是与日俱增的“二孩”家庭。随着“二孩”的降生,家庭结构发生变化,部分“大孩”无法适应身份转变,以致出现一系列焦虑、嫉妒、退行、攻击等心理及行为问题,同胞间冲突频繁。同胞关系作为人生中持续时间最长的一种“强制性”关系,它的质量将影响着个体的成长和家庭的和谐。因此,本文就将对改善二孩家庭中的消极同胞关系展开实务研究。首先,本研究以马边县W小学的在校小学生为样本,抽取4、5、6等三个年级的学生进行同胞关系和依恋关系问卷调查,通过统计学的分析,研究发现:该小学的独生子女的依恋水平略高于非独生子女,并且母子依恋略高于父子依恋;儿童同胞关系受到性别、父母外出打工情况、家庭经济状况、家庭成员关系和父母的管教方式的影响;有部分儿童确实有改善消极同胞关系的需要,主要表现在同胞竞争、同胞冲突以及同胞亲密度低等方面,且W小学儿童的亲子依恋水平与同胞关系呈显著正相关。其次,根据问卷调查和访谈,筛选出竞争冲突较多,亲密度较低的同胞儿童,找出具有相同人口学结构特征的消极同胞关系两对,一对作为实验组,一对作为对照组。通过问卷评定同胞关系以及儿童依恋的状态,运用家庭系统理论,以依恋理论为指导去分析存在的问题和原因。通过社会工作者的介入去修复和提升家庭中各子系统的依恋关系,对同胞关系前后测的测量结果进行对比分析,了解社会工作介入后,改善消极同胞关系的情况以及对个案家庭产生的积极影响。有助于丰富社会工作研究“二孩家庭”儿童同胞关系的理论视角;探究在依恋理论视角下改善消极同胞关系的方法,并验证社会工作运用依恋理论改善消极同胞关系的有效性。最终研究结果表明:经过社会工作专业方法介入的实践,同胞儿童的依恋水平分别从2.6和3.05提升到了3.6和3.95;同胞关系平均分从2.73和3.04提升到了3.24和3.57,且主观成效明显。可见,通过改善家庭各子系统的依恋状况,可以改善消极的同胞关系,具有现实意义。最后对研究进行了总结和反思。

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猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（R98株）安全性与临床免疫效果观察

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作者：孟伟民南京农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种传染病，以妊娠母猪流产、早产、死胎及仔猪咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状等特征，并已造成养猪业巨大损失。目前，国外商品化疫苗主要有PRRSV灭活疫苗和弱毒活疫苗，但我国只有... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种传染病，以妊娠母猪流产、早产、死胎及仔猪咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状等特征，并已造成养猪业巨大损失。目前，国外商品化疫苗主要有PRRSV灭活疫苗和弱毒活疫苗，但我国只有灭活疫苗。为研究开发安全有效的PRRS活疫苗，本研究通过猪体试验，系统研究观察了将PRRSV-R98株活疫苗安全性及临床免疫效果。 (一)疫苗安全性试验最小免疫日龄仔猪不同免疫途径一次单剂量接种：取7日龄哺乳仔猪12头，分为3组，每组4头，第1组肌肉注射稀释过的疫苗，接种剂量10TCID／ml;第2组滴鼻途径接种稀释过的疫苗，接种剂量10TCID／ml;第3组为对照组肌肉注射细胞培养液，1.0ml／头，隔离饲养30天，结果为以肌肉注射和滴鼻免疫接种，两个途径接种的仔猪和对照组猪均无临床异常反应，试验组仔猪体重与对照组仔猪体重无差异。鼻拭子PRRSV RT-PCR检测结果为两个途径接种组猪免疫后1-2周为阳性，第3-4周为阴性，对照组猪RT-PCR检测PRRSV均为阴性。仔猪单剂量重复接种：取14日龄哺乳仔猪10头，分为2组，每组5头，第1组肌肉注射稀释过的疫苗，接种剂量10TCID／ml，接种后2周，再用相同剂量免疫一次;第2组为对照组肌肉注射细胞培养液，1.0ml／头，接种后2周，再用相同剂量接种一次。隔离饲养30天，结果为两组猪均无临床异常反应，仔猪体重无差异。鼻拭子PRRSV RT-PCR检测结果与上述相同。仔猪一次超剂量接种：取14日龄哺乳仔猪10头，分为2组，每组5头，第1组肌肉注射稀释过的疫苗，接种剂量10TCID／ml;第2组为对照组肌肉注射细胞培养液，1.0ml／头，隔离饲养30天，结果为两组猪均无临床异常反应，仔猪体重无差异。鼻拭子PRRSV RT-PCR检测结果与上述相同。后备母猪：取后备母猪10头分为2组，每组5头，第1组肌肉注射2×10TCID／ml疫苗病毒液，第2组为对照组肌肉注射细胞培养液，2.0ml／头，隔离，观察猪有无临床症状。当配种怀孕后观察母猪繁殖情况，结果为疫苗接种后备母猪和对照组猪均无临床异常反应，体温正常。配种怀孕直到分娩，产仔正常，未出现早产，木乃伊胎等繁殖障碍现象。怀孕母猪：取怀孕约90天的母猪6头，分为2组，每组3头，第一组颈部肌肉注射2×10TCID／ml疫苗病毒液，第二组注射细胞液作为对照，2.0ml／头，各组母猪在相同条件下分开饲养，观察至母猪分娩，结果为疫苗接种母猪和对照组猪均无临床异常反应，体温正常，产仔正常，未出现早产，木乃伊胎等繁殖障碍现象。仔猪疫苗接种对猪瘟疫苗免疫的影响：取14日龄哺乳仔猪12头，分为3组，每组4头，第1组肌肉注射稀释过的疫苗，接种剂量10TCID／ml;第2和3组猪肌肉注射细胞培养液，1.0ml／头。接种后第14天，第1、2组所有猪肌肉注射猪瘟疫苗，2头份／头，第3组为空白对照组。隔离饲养观察至第30天，用正向间接血凝抑制试验检测猪瘟血清抗体，结果为两个猪瘟疫苗组猪瘟抗体效价相似。 (二)疫苗临床免疫效果观察将在瑞普(保定)生物药业有限公司生产的5批猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)活疫苗(R98株)中试产品，在江苏省淮安、盐城和苏州地区选择了部分猪进行了临床试验。临床试验结果表明，免疫猪均未出现不良反应，抽检PRRS抗体均为阳性，免疫仔猪的发病率降低，成活率均能提高至90％以上，母猪的死产率、不孕率及弱仔率均明显降低50％以上。上述试验结果证明，该疫苗对7日龄以上猪和怀孕母猪，均有较好的安全性。仔猪接种疫苗后1～2周内可以排毒。该疫苗接种仔猪后对猪体免疫功能无影响，免疫效果确实。

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猪繁殖与呼吸综合征病毒编码蛋白对TLR3和IL-10表达的影响

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作者：王海南京农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原之一,造成巨大经济损失。PRRSV可通过多种途径宿主逃避免疫应答,包括调节IL-10、抑制巨噬细胞和树突状细胞功能和抑制Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)产生等,从而导致病毒持续感染,但其... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原之一,造成巨大经济损失。PRRSV可通过多种途径宿主逃避免疫应答,包括调节IL-10、抑制巨噬细胞和树突状细胞功能和抑制Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)产生等,从而导致病毒持续感染,但其分子机制尚不十分清楚。为了探究PRRSV编码蛋白对TLR3和IL-10表达影响,本研究构建了PRRSV部分非结构蛋白的真核表达质粒,证明Nsp1和Nsp11可以抑制TLR3启动子活性,初步探索了其可能机制;同时还构建了PRRSV结构蛋白真核表达质粒,证明GP5和N蛋白可以诱生IL-10表达;另外,还构建了Nsp4,Nsp7,Nsp12的真核表达质粒,观察了其作为基因疫苗的免疫特性。具体研究内如下：*** 3个非结构蛋白对TLR3启动子活性的影响及其机理PRRSV ORF1a和ORF1b可以翻译形成14个病毒非结构蛋白,其中部分非结构蛋白具有抑制I型干扰素活性的功能。TLR3是先天性免疫中重要的受体分子,它经dsRNA刺激后可以诱导产生干扰素和促炎症因子,启动先天性免疫反应。为了探究PRRSV非结构蛋白对TLR3转录表达的影响,本研究构建了PRRSV BB0907毒株Nsp1,Nsp1α、Nsp1α-△14、Nsp1β、Nsp7和Nsp11蛋白的真核表达质粒,利用双荧光素酶报告系统,检测了以上各蛋白对TLR3启动子活性的影响,发现Nsp1、Nsp1α和Nsp1β具有抑制TLR3启动子活性的能力,并且Nsp1α的C端锌指结构是其抑制活性所必须的。同时,Nsp11也具有抑制TLR3启动子活性的能力,并且呈剂量依赖关系;而且,Nsp11能够显著的抑制INF-β诱导下的TLR3启动子活性,表明Nsp11可能具有抑制JAK-STAT通路的活性。此结果在一定程度上解释了PRRSV易造成宿主先天性免疫低下原因,并为后续研究Nsp11的免疫抑制机理奠定了基础。***结构蛋白的真核表达及其对IL-10启动子活性的影响PRRSV可以通过诱导IL-10的产生来抑制免疫应答,造成持续性感染。为了探究PRRSV结构蛋白对IL-10的诱生能力,本研究首先构建了PRRSV BB0907毒株各结构蛋白的重组真核表达质粒,并在BHK-21细胞中利用间接免疫荧光的方法鉴定了其表达,再利用双荧光素酶报告系统,在PAM(3D4/2)细胞中检测其对IL-10启动子的激活能力。结果显示,GP5和N蛋白都能够显著性的激活IL-10的启动子,此为后续研究PRRSV诱生IL-10的具体机制奠定了基础。*** Nsp4、Nsp7和Nsp12基因疫苗的构建及其免疫特性研究猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起猪的一种高度传染性疾病,为了有效控制该病,人们一直致力于通过筛选更有效的靶抗原来研制新型的PRRSV疫苗。然而现阶段,对靶抗原的筛选主要集中在PRRSV的结构蛋白上,对非结构蛋白的研究相对较少。为了探究PRRSV非结构蛋白作为免疫保护抗原的可行性,本研究选取了PRRSV BB090毒株Nsp4、Nsp7和Nsp12三种没有免疫抑制功能的非结构蛋白作为免疫靶蛋白,利用pcDNA3.1真核表达系统,并辅以GM-CSF基因作为免疫增强佐剂,KDEL序列作为目的蛋白定位序列,构建基因疫苗,并进行小鼠免疫试验,结果显示,真核表达的Nsp4、Nsp7和Nsp12能够引起一定的小鼠体液免疫应答,并且GM-CSF可以增强这种免疫应答,但是细胞免疫应答效果却不理想,为进一步对PRRSV疫苗候选抗原蛋白的筛选提供了一定理论基础。

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猪伪狂犬病毒新流行毒株抗原变异与灭活疫苗体液免疫特性研究

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作者：杨文萍南京农业大学

学位级别：硕士

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,是一种有囊膜的双链DNA病毒,可感染牛、羊、狗、猫、山羊、鸡、浣熊及野生动物等,猪是伪狂犬病毒的天然宿主。伪狂犬病主要引起新生仔猪的神经症状和死亡,以及妊... 详细信息

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,是一种有囊膜的双链DNA病毒,可感染牛、羊、狗、猫、山羊、鸡、浣熊及野生动物等,猪是伪狂犬病毒的天然宿主。伪狂犬病主要引起新生仔猪的神经症状和死亡,以及妊娠母猪流产、死胎,在猪群中常呈爆发流行,对我国乃至全世界的养猪业造成了巨大损失。2011年以来,我国很多PRV疫苗免疫的规模化猪场爆发伪狂犬病疫情。2011年底,浙江某规模猪场免疫猪群爆发疫情,本实验室从疑似伪狂犬病的仔猪脑组织病料中分离获得PRV ZJ-01株。本文对PRV新分离毒株ZJ-01的中和抗原特性进行分析鉴定,并对PRV灭活疫苗进行了初步研究。具体研究内容如下：1.伪狂犬病毒新流行毒株中和抗原特性为了进一步了解PRV毒株ZJ-01是否存在抗原变异,我们选择不同商品化PRV活疫苗(Bartha-K61、Bucharest和HB-98株)免疫的3个规模化猪场健康猪群,分别采集9—11份仔猪血清,采用PRV gB和gE ELISA抗体试剂盒(IDEXX公司)检测抗体,结果为：gB抗体均为阳性,gE抗体均为阴性。采用PRV新流行毒株ZJ-01株和传统的PRV LA毒株分别进行血清中和抗体测定,结果显示,3个毒株活疫苗免疫血清与ZJ-01株中和抗体效价明显低于其与LA株中和抗体效价。同时,ZJ-01株抗血清10份与ZJ-01株和LA株的中和抗体效价相似,计算出其变异系数R值为0.255～0.378,证明该猪场流行的PRV毒株抗原性发生明显变异,从而为控制该病的传播和蔓延及新型疫苗研制奠定了理论基础。2.伪狂犬病毒灭活疫苗制备与小鼠体液免疫特性本研究采用甲醛和过氧化氢两种灭活剂对重组伪狂犬病毒毒株(rZJ-011G)分别进行灭活处理,筛选出灭活条件为：0.1%甲醛37℃处理12h和14h;1%过氧化氢4℃灭活处理4h和5h。将灭活病毒液与CPH水性佐剂混合制成灭活疫苗,取6～8周龄ICR清洁级小鼠随机分为5组,每组10只,第1～4组分别接种上述4种灭活疫苗,0.2m1/只,第5组皮下注射DMEM营养液作为阴性对照,间隔3周后用相同方法加强免疫一次,隔离饲养观察。首免后第3、6周分别采血,检测PRV ELISA抗体水平,第6周检测其中和抗体水平。结果为：首免后3周,4个疫苗组即可检测到ELIS (?)抗体,加强免疫后ELISA抗体平均达1：17000;0.1%甲醛12h灭活疫苗组中和抗体平均为1：8,而过氧化氢灭活疫苗组无明显中和抗体,表明PRV甲醛灭活效果优于过氧化氢灭活效果,从而为该病疫苗研究奠定了基础。

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