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作者：王亚鹏甘肃农业大学

学位级别：硕士

马铃薯块茎休眠的形成及解除是多种激素以及多基因表达调控的结果,转录因子在植物生长代谢信号转导过程中多数情况下处于信号通路的上游,对相应下游基因的表达起重要的调节作用。根据本实验室RNA-seq测序结果,发现大量转录因子参与马铃... 详细信息

马铃薯块茎休眠的形成及解除是多种激素以及多基因表达调控的结果,转录因子在植物生长代谢信号转导过程中多数情况下处于信号通路的上游,对相应下游基因的表达起重要的调节作用。根据本实验室RNA-seq测序结果,发现大量转录因子参与马铃薯块茎休眠解除过程的调控,植物TCP转录因子是植物特有的一类转录因子,它们与植物细胞的增殖与生长密切相关,主要涉及植物生长发育过程的调节,对植物分枝的生长,叶片发育,分化芽的产生,花的发育,种子休眠的调控,以及激素代谢等过程具有重要的调节作用。本论文首先进行马铃薯块茎休眠期间的转录组数据分析,随后利用生物信息学方法对马铃薯TCP转录因子家族基因进行鉴定及功能分析,在马铃薯基因组中鉴定出31个非冗余TCP转录因子,并对这些基因进行功能结构以及表达特异性分析。随后以马铃薯栽培种“费乌瑞它”为实验材料,以盆栽苗叶片作为激素响应方面的研究材料,使用大小一致外形均匀的块茎作为休眠解除过程的研究材料,利用实时荧光定量(qRT-PCR)方法对所有StTCP转录因子家族基因进行表达量分析。主要取得的研究结果如下:1.在马铃薯块茎休眠解除的过程中,通过差异表达基因富集分析发现,在休眠块茎细胞中与DNA复制相关的基因被抑制,细胞代谢活动停滞,休眠解除之后DNA复制相关的基因开始转录,DNA复制被激活,代谢开始。在分化芽出现后,与光合作用相关的基因大量表达,利用块茎储存物质生产有机物并提供能量,为分化芽的发育提供基础,并在马铃薯块茎休眠解除期间发现了大量表达量上调的差异表达转录因子。2.使用TCP结构域(PF03634)作为询问序列,构建隐马尔克夫模型在马铃薯基因组上共查询获得46个StTCP转录因子家族基因,通过提交氨基酸序列到InterPro数据库以确定基因结构域的完整性,总共去除了15个冗余的StTCP转录因子家族基因,最终获得31个非冗余的StTCP转录因子家族基因。3.通过进化以及共线性分析发现StTCP转录因子家族基因可以被分为两个亚家族三个分组,并与拟南芥、番茄存在大量的共线性基因,结构域分析发现同一个分组内StTCP基因具有相似的保守结构域。基因结构研究发现几乎所有的StTCP基因具有高度保守的外显子-内含子结构,并在StTCP基因启动子区发现了大量关于植物生长、发育以及响应激素及逆境胁迫的启动子结合元件。4.表达量分析发现7个StTCP基因表达量在马铃薯休眠解除过程中出现急剧上调,部分StTCP基因在激素处理的情况下出现显著的变化。结合共线性、GO、KEGG注释以及表达量分析发现StTCP15和StTCP23可能具有促进马铃薯块茎休眠解除及分化芽生长的功能。5.在马铃薯栽培品种“费乌瑞它”cDNA中扩增出了StTCP23基因,并利用同源重组的方法将StTCP23基因插入到线性化后的马铃薯过表达载体pBI121中,构建了pBI121-TCP过表达载体。

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miR164-GhNAC100和GhWRKY22参与棉花抗黄萎病的机制分析

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作者：雷煜甘肃农业大学

学位级别：硕士

随着分子生物学不断的发展以及miRNA的功能发现,对于植物抗逆研究又有了新的突破口。在模式植物拟南芥中miR164调控植物的叶片和侧根发育及病原菌等非生物与生物胁迫。近几年来,逐渐展开了棉花mi RNA调控机制的研究,有关miR164调控棉花... 详细信息

随着分子生物学不断的发展以及miRNA的功能发现,对于植物抗逆研究又有了新的突破口。在模式植物拟南芥中miR164调控植物的叶片和侧根发育及病原菌等非生物与生物胁迫。近几年来,逐渐展开了棉花mi RNA调控机制的研究,有关miR164调控棉花生理生化方面的报道越来越多,但有关miRNA调控棉花抗病性及其机制分析研究罕有报道。WRKY蛋白是最大转录因子家族之一,在植物调控网络中占有举足轻重的地位,有关棉花抗病WRKY转录因子的研究已经有一些报道。然而,棉花中WRKY蛋白参与抗病反应等分子机制有待于进一步研究。本研究对miR164及其靶基因GhNAC100和GhWRKY22参与棉花抗黄萎病性进行了研究,取得主要结果如下:1.通过sRNA组学和降解组测序数据分析,筛选出黄萎病病原菌(大丽轮枝菌,Verticillium dahliae)诱导表达差异显著的miR164及其预测靶基因GhNAC100。其表达进一步验证表明,在棉花接菌7 d后miR164表达显著下降,而靶基因GhNAC100表达呈现相反趋势。2.克隆了GhNAC100的全长基因及miR164的前体pre-miR164;构建了过表达载体pBI121-NACW、pBI-121-pre-miR164、pBI-121-NACM,并转入农杆菌GV3101中,进行烟草瞬时表达。结果表明了miR164能够降解其靶基因GhNAC100的mRNA,具有转录后调控作用。3.对棉花进行***侵菌处理,结果发现接菌后GhNAC100的表达受到显著地诱导;并分析了茉莉酸甲酯(MeJA)与水杨酸(SA)两种激素诱导下GhNAC100的表达,结果显示GhNAC100响应SA和JA信号途径的诱导。4.构建了GhNAC100基因的病毒诱导沉默载体pYL-156-GNAC,将其转移到农杆菌GV3101中,注射棉花子叶获得GhNAC100基因沉默植株。对这些沉默植株接种***并进行抗性分析,结果表明棉花GhNAC100沉默植株更易感病,***病原菌回复率相对于对照显著提高。在GhNAC100沉默植株接菌72 h后,SA和JA抗病标志基因PR1、PDF1.2表达水平显著低于对照植株,暗示GhNAC100基因可能通过SA和JA信号途径参与棉花对***的抗性。5.利用生物信息学筛选出8个与拟南芥直系同源的棉花抗病相关WRKY基因,其对***诱导呈现不同的表达模式,其中GhWRKY22表达显著响应病原菌的诱导。在MeJA和SA的处理下,GhWRKY22基因表达显著上升,暗示该基因受到SA和JA信号途径的调控参与棉花抗病反应。6.利用植物病毒诱导基因沉默(VIGS)技术获得Gh WRKY22沉默棉花植株,该基因表达量被沉默了60%以上。对沉默植株接种***,结果显示基因沉默植株表现为对病原菌侵染更敏感,发病率与病值、病原菌回复率均明显高于对照组。同时,分析抗病标志基因PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1.2表达情况,结果显示这些抗病标志基因的表达量显著低于对照植株,揭示了Gh WRKY22基因是通过SA和JA信号途径参与棉花对***的抗性。

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可溶性淀粉合成酶SSIII基因对马铃薯的遗传转化

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作者：杜宏辉甘肃农业大学

学位级别：硕士

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是淀粉生产中重要的农作物之一。淀粉是大多数植物当中主要的贮藏碳水化合物,它分为直链淀粉和支链淀粉两种。支链淀粉占总淀粉含量的80%左右,是由α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键连接而成的具有分支结构的多聚... 详细信息

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是淀粉生产中重要的农作物之一。淀粉是大多数植物当中主要的贮藏碳水化合物,它分为直链淀粉和支链淀粉两种。支链淀粉占总淀粉含量的80%左右,是由α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键连接而成的具有分支结构的多聚糖,而直链淀粉是由α-1,4糖苷键连接而成的线性多聚糖。目前在生产上推广的马铃薯栽培品种,其淀粉糊化温度、粘度、冻融稳定性都不太理想。因此,选育出更适合于加工业领域的马铃薯新品系,对于马铃薯的淀粉加工产业有重要的意义。本研究通过根癌农杆菌介导法将组成型表达启动子CaMV 35S和块茎特异型表达启动子CIPP驱动的可溶性淀粉合成酶(SSⅢ)基因导入到马铃薯栽培品种克新1号和克新4号中,获得转基因马铃薯植株,为进一步明确SSⅢ基因在淀粉合成中的功能和获得淀粉改良的马铃薯新种质提供基础。取得的主要研究结果如下:1.以马铃薯栽培品种克新1号和克新4号的试管薯为供体材料,分别用组成型表达启动子CaMV 35S和块茎特异型表达启动子CIPP驱动的可溶性淀粉合成酶(SSⅢ)基因干扰表达载体pBI-SSⅢ-RNAi和pBIC-SSⅢ-RNAi进行遗传转化,获得了65株转化植株。通过PCR检测初步表明有31株中SSⅢ基因的干扰片段已整合到马铃薯基因组中。2.将PCR结果呈阳性的马铃薯转基因植株移栽至温室蛭石中,4个月后收获微型薯。通过半定量RT-PCR检测初步说明有19株中SSⅢ基因在转录水平上已受到了抑制。3.对转SSⅢ基因马铃薯淀粉颗粒形态、支/直淀粉含量及淀粉中磷含量进行了观察和测定。结果表明有9个转基因植株的淀粉颗粒形态发生了明显的变化,其淀粉颗粒中心出现裂痕;这9个转基因马铃薯植株中直链淀粉含量都不同程度的有所增加,其中直链淀粉含量最低为14.55 %,最高为17.59 %,比未转基因的对照植株增加了2.68 %～29.05 %;与未转基因的对照植株相比,转基因植株的支/直淀粉比都有不同程度的降低;与未转基因的对照植株相比,克新1号的6个转基因株系的淀粉磷含量降低了9.94 %～58.36 %,克新4号的3个转基因株系的淀粉磷含量降低了34.76 %～56.04 %。

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马铃薯StRFP2基因的遗传转化及其抗旱性研究

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作者：祁学红甘肃农业大学

学位级别：硕士

泛素-蛋白酶体途径（UPP）是一种可逆的、存在于真核细胞中的蛋白质选择性降解的主要途径,决定泛素化过程特异性的泛素连接酶E3在调节植物逆境胁迫或应激反应等方面起着至关重要的作用。本课题组在前期的RNA-seq研究中发现马铃薯RING型... 详细信息

泛素-蛋白酶体途径（UPP）是一种可逆的、存在于真核细胞中的蛋白质选择性降解的主要途径,决定泛素化过程特异性的泛素连接酶E3在调节植物逆境胁迫或应激反应等方面起着至关重要的作用。本课题组在前期的RNA-seq研究中发现马铃薯RING型泛素连接酶基因StRFP2在干旱胁迫下显著上调。本研究通过亚细胞定位确定了StRFP2基因在细胞中的表达部位;利用qRT-PCR检测马铃薯中StRFP2基因的组织特异性表达以及干旱胁迫响应;通过农杆菌介导的方法获得StRFP2基因的过表达和干扰表达的转基因马铃薯,进一步分析其抗旱性,从而为深入解析其抗旱机理提供基础。取得了如下主要研究结果:1.通过同源重组的方法构建pCEGFP-StRFP2融合蛋白瞬时表达载体,由农杆菌介导转化到烟草中,用激光共聚焦扫描显微镜观察发现StRFP2蛋白主要定位在细胞膜和细胞质中。2.通过qRT-PCR分析温室下的马铃薯盆栽苗“Atlantic”和“Qingshu 9”中StRFP2基因的组织特异性表达和干旱胁迫响应,结果发现StRFP2基因在两个品种的根、茎、叶中存在差异性表达,在叶中的表达量均最高;在“Atlantic”中StRFP2基因对干旱更加敏感,随着干旱程度的加深,StRFP2基因的表达量呈先上升后下降的趋势,由此说明StRFP2基因通过正调控来响应干旱胁迫。3.通过农杆菌介导的转化途径获得了转pCPB-StRFP2过表达马铃薯植株及转pCPB121-amiR-StRFP2干扰表达马铃薯植株。对转基因马铃薯的表型分析表明StRFP2基因的过表达正向促进了马铃薯的生长,而干扰表达抑制其生长。4.用qRT-PCR分析了转基因植株在PEG渗透胁迫下StRFP2的相对表达量,结果表明,在PEG处理下,StRFP2基因的表达量均上调,但是过表达植株中StRFP2基因的表达量高于非转基因植株（WT）,干扰表达植株中StRFP2基因的表达量低于WT植株。5.在PEG渗透胁迫下,测定了转基因植株的游离脯氨酸（Pro）含量、过氧化氢酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量和相对含水量。结果发现,过表达植株中Pro含量、CAT活性、相对含水量均高于WT植株,MDA低于WT植株,而干扰表达植株则相反。这表明StRFP2基因通过改变渗透调节物质来响应干旱胁迫。

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GhCOI1和GhMYC2基因对棉花黄萎病抗性的VIGS分析

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作者：范强甘肃农业大学

学位级别：硕士

为了对抗生物或非生物逆境胁迫,植物在漫长的进化中获得了相应的生理机能来行使应答或防御功能。作为一类非常重要的自身代谢物,植物激素在其生长发育过程中的作用是其它种类化合物无法直接替代的。茉莉酸(Jasmonate acid,JA)及其衍生... 详细信息

为了对抗生物或非生物逆境胁迫,植物在漫长的进化中获得了相应的生理机能来行使应答或防御功能。作为一类非常重要的自身代谢物,植物激素在其生长发育过程中的作用是其它种类化合物无法直接替代的。茉莉酸(Jasmonate acid,JA)及其衍生物质能直接诱导并调节植物防御反应,调控许多相关的转录因子的来行使各种生理功能。人们对于茉莉素类信号转导过程已有了初步了解,发现了许多调控效应基因和关键应答调节转录因子,目前为止对其都已经有了较多报道与研究,但是在农作物,尤其在棉花等经济作物中的研究尚需进一步深入。植物中冠菌素不敏感因子(Coronatine-insensitive 1,COI1)是茉莉酸(Jasmonate,JA)信号转导途径的关键调控因子。在拟南芥中,COI1缺失突变体表现为对各种茉莉酸应答反应不敏感或者不响应,在受到病原菌侵染时不能及时反馈信号分子,无法使得相应应答反应基因表达。研究表明,植物中髓细胞组织增生蛋白(Myelocytomatosis proteins,MYCs)是茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子,并广泛的存在于动植物中。MYC2转录因子属于植物螺旋-环-螺旋转录因子家族(basic helix-loop-helix protein,bHLH),它对JA信号的传递起着非常重要的作用。病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是指病毒载体侵染植物后,能够诱导当代植物发生内源性基因沉默而出现表型变化的一种研究基因功能的技术。我们通过生物信息学分析克隆出棉花中的COI1基因和MYC2相关基因,通过上述VIGS方法沉默陆地棉中GhCOI1和GhMYC2这两个基因,分析其对V991的抗病反应,确定它们在棉花中的抗病性,为棉花在抗病育种方面的研究提供实验数据分析,同时为深入理解植物响应逆境胁迫的分子机制做出初步研究。取得的研究结果如下:1.通过NCBI数据库(http://***/)分析,电子克隆棉花相关的COI1和MYC2基因全长序列。用DNAMAN软件设计引物,以棉花基因组cDNA为模版扩增出目的基因全长,经酶切和测序鉴定,克隆GhCOI1与GhMYC2两个基因。2.我们对GhCOI1与GhMYC2两个基因表达的组织特异性进行分析,结果显示两个基因均在根中优势表达。对试验棉花接种V991后,结果显示GhCOI1与GhMYC2基因表达受到大丽轮枝菌侵染的诱导;GhCOI1在接种病菌12h后表达量最高,GhMYC2在接种3h后表达最高,随着时间的增加这两个基因表达量有所下降,但总体来说呈现上升趋势。3.针对目标序列通过Primer5.0软件设计特异引物,扩增得到沉默靶基因序列后再将该序列插入到病毒载体pYL-156上。经酶切和测序鉴定后,得到重组载体pYL-156-GhCOI1和pYL-156-GhMYC2。利用电击法将上述重组载体转入根癌农杆菌GV3101中,得到VIGS工程菌。在未长出真叶的棉花幼苗子叶上接种制备好的VIGS工程菌,获得沉默植株。4.待参照基因PDS出现叶漂白表型(白斑或完全失绿)后,提取对照植株和目的基因沉默植株的总RNA,反转录cDNA第一链后进行RT-PCR和qPCR检测。结果表明,沉默植株目标基因的表达均被抑制,基因沉默效果在85%以上。5.对上述GhCOI1和GhMYC2沉默植株分别接种致病菌V991,结果指出这两个基因沉默植株对大丽轮枝菌的耐受性减弱,表型显示它们更容易感染病菌,而对照植株对大丽轮枝菌有明显的耐病性。这些结果阐明了两个目的基因直接参与了棉花对大丽轮枝菌的抗性反应,而且GhCOI1和GhMYC2正调控棉花的抗病性。

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马铃薯块茎光照变绿时质体和线粒体DNA含量的变化

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作者：张国栋甘肃农业大学

学位级别：硕士

细胞核基因组、质体基因组、线粒体基因组的协调表达是植物正常生长、发育的必要条件。此前有研究报道植物的质体基因组DNA和线粒体基因组DNA会因光照而降解。在叶绿体光合磷酸化产生的ATP是否会降低细胞对线粒体的需求这两个问题上也... 详细信息

细胞核基因组、质体基因组、线粒体基因组的协调表达是植物正常生长、发育的必要条件。此前有研究报道植物的质体基因组DNA和线粒体基因组DNA会因光照而降解。在叶绿体光合磷酸化产生的ATP是否会降低细胞对线粒体的需求这两个问题上也存在争论。大多数对变绿过程中叶绿体基因组的研究是以植物的叶片为材料,还缺乏对其他组织器官中的研究,因此我们还不确定植物不同组织器官的叶绿体基因组在稳定性等方面是否存在共性。在本研究中,我们采用马铃薯品种“费乌瑞它”和“夏波蒂”的块茎为实验材料,每一品种的块茎分成两组,分别进行光照(变绿)处理和避光处理;费乌瑞它的光照实验包含两组重量不同的块茎,以研究不同重量块茎在变绿时DNA含量的变化。在经过光照(变绿)处理和避光处理后,光照组削取1-2 mm厚的块茎表层变绿组织以提取总DNA,避光组则削取与光照组相同部位的组织。然后采用实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction;简称real-time PCR)和长链聚合酶链式反应(Long PCR)的方法来分析块茎表皮组织的总DNA。***-time PCR实验中的参考引物对B20B22为核基因组(Solanum tuberosum cultivar DM 1-3 516 R44 unplaced genomic scaffold,SolTub.0scf00001,whole genome shotgun sequence)单拷贝区;叶绿体引物对C5C6扩增序列位于叶绿体基因组accD基因(乙酰辅酶A羧化酶β亚基基因acetyl-Co A carboxylase beta subunit)的单拷贝区;线粒体引物对C13C14、C15C16扩增序列位于线粒体基因组的单拷贝区,C13C14对应线粒体ATPase 6基因的片段,C15C16对应线粒体COX I基因的片段,两个基因分别为线粒体呼吸功能关键酶ATP合成酶(ATPase)和细胞色素C氧化酶(COX)的蛋白亚基编码基因,以上引物对依据Li等(未发表)。通过real-time PCR数据分析表明:块茎重量相似时,光照处理组的块茎变绿组织总DNA与避光处理组的块茎表皮组织总DNA相比,其质体基因组DNA拷贝数有所降低,线粒体基因组DNA拷贝数也表现出明显地降低;这一结果在马铃薯品种“费乌瑞它”和“夏波蒂”的块茎中均有表现。这可能表明了在经过光照处理的两个马铃薯品种的块茎变绿组织中,细胞对质体总量的需求有所降低,以及细胞降低了对线粒体呼吸作用产生ATP的需求。在块茎重量不同的情况下,较重块茎的细胞器基因组DNA拷贝数多于较轻的块茎。较重块茎变绿组织的叶绿体基因组DNA拷贝数较多;C13C14所扩增的ATPase 6基因拷贝数增加显著(P<0.05),C15C16扩增的COX I基因拷贝数增加极显著(P<0.01)。*** PCR的实验中,我们选取马铃薯叶绿体基因组中一段长度为8033bp(GenBank accession ***772171基因组的7261-15293位置)的序列设计引物。马铃薯品种“费乌瑞它”和“夏波蒂”的光照变绿组织的总DNA中均成功扩增出了长度约8000 bp的序列,结果表明质体基因组DNA基本稳定。这些结果表明在两个品种的块茎变绿组织中质体基因组DNA拷贝数受光照影响而降低,随块茎质量增大而增加;变绿组织线粒体DNA的拷贝数受光照影响降低,随块茎重量增大而增加。

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马铃薯miR156靶向作用SPL基因调控侧根发育的机理研究

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作者：罗红玉甘肃农业大学

学位级别：硕士

MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小分子RNA,通常在转录后水平负调节靶基因表达,在植物生长发育的每个阶段都发挥着不可或缺的作用。miR156是一类进化上高度保守的miRNA家族之一,马铃薯Stu-miR156包含11个成员,调控靶基因SPL家族... 详细信息

MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小分子RNA,通常在转录后水平负调节靶基因表达,在植物生长发育的每个阶段都发挥着不可或缺的作用。miR156是一类进化上高度保守的miRNA家族之一,马铃薯Stu-miR156包含11个成员,调控靶基因SPL家族广泛参与植物的生长发育、激素应答、逆境胁迫响应和光合作用等代谢过程。但关于miR156对马铃薯生长发育和响应干旱胁迫的研究很少。本研究通过amiRNA技术和STTM技术构建马铃薯Stu-miR156过表达载体和沉默表达载体Stu-miR156STTM,转化马铃薯栽培品种“Desiree”获得转基因植株。qRT-PCR分析转基因植株中Stu-miR156及靶基因StSPL9的表达量,统计分析侧根数量及侧根长度,为进一步研究miR156/SPLs模块参与调控马铃薯侧根发育提供理论依据。本研究取得的主要结果如下:1.马铃薯Stu-miR156生物信息学分析表明有11条前体序列,加工形成16条成熟序列。通过靶基因在线预测工具psRNATarget发现靶基因StSPL9第1296-1316个碱基处被Stu-miR156靶向结合。2.构建靶基因StSPL9植物瞬时表达载体pCAM-GFP-SPL9并注射本氏烟草。激光共聚焦显微镜观察荧光分布情况,结果显示pCAM-GFP定位于细胞膜、细胞核和细胞质,pCAM-GFP-SPL9初步判断定位于细胞质和细胞核。3.利用人工miRNA技术构建马铃薯pCPB121-miR156过表达载体,以马铃薯栽培品种“Desiree”无菌苗为实验材料,利用农杆菌转化马铃薯试管苗获得转基因植株。qRT-PCR分析Stu-miR156及靶基因StSPL9在转基因植株根、茎和叶中的表达量。结果表明:Stu-miR156在转基因植株根、茎和叶中表达量均上调。而靶基因StSPL9在根、茎和叶中表达量均下调,说明Stu-miR156负调控靶基因的表达,从而参与马铃薯生长发育。4.根据STTM的茎环结构设计引物,以BamHⅠ和HindⅢ为酶切位点,构建沉默表达载体Stu-miR156STTM并转化马铃薯获得转基因植株。qRT-PCR分析Stu-miR156及靶基因StSPL9在转基因植株根、茎和叶中的表达量。结果表明:Stu-miR156在转基因植株中均下调表达,而靶基因StSPL9均上调表达量,说明STTM技术高效沉默miRNA的表达。5.每个转基因株系分别随机选取3株,统计分析侧根数目、侧根长度和株高等发现:与野生型相比,过表达Stu-miR156转基因植株侧根数量显著增加,根长和株高均显著性降低;而Stu-miR156STTM沉默表达转基因植株的侧根数目显著减少,茎秆变细,侧根长度和株高均降低,说明miR156调控植物生长发育。

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马铃薯miRNA164及其靶基因功能研究

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作者：姚磊甘肃农业大学

学位级别：硕士

MicroRNAs(miRNAs)是内源性的调节基因转录后水平的一类小分子RNA。NAC转录因子是一类在植物抗逆信号网络中发挥多种生物学功能的转录因子,干旱、盐碱等逆境胁迫能够诱导植物表达该基因。研究表明miRNA164的靶基因NAC在模式植物拟南芥... 详细信息

MicroRNAs(miRNAs)是内源性的调节基因转录后水平的一类小分子RNA。NAC转录因子是一类在植物抗逆信号网络中发挥多种生物学功能的转录因子,干旱、盐碱等逆境胁迫能够诱导植物表达该基因。研究表明miRNA164的靶基因NAC在模式植物拟南芥中参与调控植物的生长发育以及对生物和非生物胁迫的耐受性。目前在马铃薯中关于miRNA164参与调控NAC表达模式的研究尚未见报道。本研究利用mi RNA164/NAC表达模式的保守性,用马铃薯中已知的miRNA164序列,通过在线工具对其靶基因进行预测并克隆获得了其靶基因NAC262,构建了其植物表达载体,转化马铃薯栽培品种“克新3号”获得了转基因植株。另外,利用人工miRNA(artificial mi RNA,amiRNA)技术构建了马铃薯mi RNA164表达载体,并转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”获得了转基因马铃薯植株。通过转基因植株NAC262基因表达量的qRT-PCR分析和形态学的观察对miRNA164/NAC的表达模式进行了研究。取得的主要结果如下:1.通过在线工具psRNATarget对miRNA164靶基因进行预测得到3个靶基因。通过生物信息学分析发现,这3个靶基因均属于NAC转录因子家族的NAM亚家族,且基因结构具有很高的保守性。2.以NCBI登记的马铃薯NAC262基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得了马铃薯转录因子基因NAC262的cDNA序列,并构建了CaMV 35S启动子驱动的NAC262基因的植物表达载体pCPB-NAC262;以马铃薯栽培品种“克新3号”无菌试管苗为实验材料,用农杆菌介导法进行遗传转化,经卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定获得了8株转基因植株。3.利用人工miRNA技术构建了CaMV 35S驱动的马铃薯mi RNA164的人工表达载体pCPB121-miR164,以马铃薯栽培品种“甘农薯2号”无菌试管苗为实验材料,经农杆菌介导法的遗传转化获得了10株转基因植株。4.用PEG6000对转基因植株进行胁迫处理,利用qRT-PCR对NAC262基因表达量分析结果显示:在20%的PEG胁迫下,0-8 h内NAC262基因表达量呈现上升的趋势,在胁迫达到8 h时NAC262基因表达量达到了最大值,在8-32 h时,NAC262基因表达量呈现下调的趋势;NAC262基因在胁迫的各个时间段根部的表达量高于茎叶组织。转mi RNA164基因株系T1和T2在PEG胁迫下,NAC262基因相对表达量明显低于非转基因“甘农薯2号”植株;而转NAC262基因株系T3和T4在PEG胁迫下,NAC262基因相对表达量明显高于非转基因“克新3号”植株。5.对每个株系随机的5株进行侧根数目和侧根长度统计发现:与非转基因对照相比,转miRNA164基因的“甘农薯2号”株系T1和T2侧根的数目明显的减少,但侧根的长度无显著的变化;而转NAC262基因的“克新3号”株系T3和T4与非转基因植株相比,侧根的数目明显的增多,根的长度变短,且叶片变大,茎秆加粗。综上所述,NAC262转录因子能够调控植物侧根的发育,且表达受到miRNA164的调控,miRNA164/NAC的表达模式存在高度的保守性,与拟南芥的类似,同时受PEG胁迫的诱导而参与了植物对干旱胁迫的响应。

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水分胁迫对马铃薯生理生化特性的影响

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作者：李建武甘肃农业大学

学位级别：硕士

本文以不同抗旱性马铃薯品种为试验材料,研究了马铃薯的抗旱生理生化特性,并探讨了马铃薯始花期干旱诱导蛋白的产生规律。在此基础上,应用灰色关联度分析法进一步明确马铃薯生理生化指标与抗旱性的关系。同时,对马铃薯试管苗进行了相同... 详细信息

本文以不同抗旱性马铃薯品种为试验材料,研究了马铃薯的抗旱生理生化特性,并探讨了马铃薯始花期干旱诱导蛋白的产生规律。在此基础上,应用灰色关联度分析法进一步明确马铃薯生理生化指标与抗旱性的关系。同时,对马铃薯试管苗进行了相同生理生化指标的测定,以期对马铃薯试管苗与盆栽苗在水分胁迫下差异性反应进行进一步比较、探讨内在联系。主要研究结果如下: 1.水分胁迫下马铃薯叶片相对含水量下降,抗旱性较强的品种下降幅度较小。2.在水分胁迫下马铃薯脯氨酸积累,游离氨基酸含量增高。盆栽马铃薯在水分胁迫后抗旱性较强的品种脯氨酸的积累幅度大于抗旱性较弱的品种,抗旱性较强的品种游离氨基酸含量增大幅度小于抗旱性较弱的品种。马铃薯试管苗脯氨酸与游离氨基酸含量的变化没有规律性,这可能与试管苗对逆境的适应能力较差有关。3.水分胁迫下马铃薯细胞内清除活性氧的保护性酶(SOD、POD、CAT)活性发生变化,盆栽马铃薯SOD 活性降低,抗旱性较强的品种降低幅度小于抗旱性较小的品种;CAT 活性上升,抗旱性较强的品种CAT 活性始终保持较高的水平,抗旱性较强的品种POD 活性增高幅度较大,对水分敏感的品种POD 活性较小。马铃薯试管苗在轻度水分胁迫(10%PEG)和重度水分胁迫(20%PEG)下SOD 活性升高,轻度水分胁迫CAT 活性升高,而在重度水分胁迫后CAT 活性降低甚至低于对照,在轻度水分胁迫后POD 活性升高,经重度水分胁迫抗旱性较强的品种POD 活性依旧上升,而其余品种降低甚至低于对照。马铃薯试管苗SOD、CAT、POD 活性变化规律性不强。4.水分胁迫后马铃薯叶片细胞膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)升高。在水分胁迫后,盆栽马铃薯MDA 含量增大,抗旱性较强的品种MDA 含量增大幅度低于抗旱性较弱的品种,并保持较低的水平。马铃薯试管苗在轻度水分胁迫下MDA 含量增大, 在重度水分胁迫后MDA 含量增大。5.水分胁迫后,盆栽马铃薯可溶性蛋白质含量增加,抗旱性较强的品种增加幅度较大。马铃薯试管苗可溶性蛋白质含量在轻度水分胁迫后增大,经重度水分胁迫后变化不一。水分胁迫可以引起蛋白质合成的变化,不同抗旱性品种发生变化的蛋白质大小有部分是相似的,也有许多是不同的。6.通过灰色关联度分析结果表明,叶片相对含水量、MDA 含量可作为马铃薯重

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