检索结果-南通市图书馆

作者：张蕊上海海洋大学

学位级别：硕士

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)。因其具有适应性强、生长快、繁殖力高和食性广等优点，被联合国粮农组织定为向世界各国推荐的养殖对象。中国为罗非鱼养殖的... 详细信息

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)。因其具有适应性强、生长快、繁殖力高和食性广等优点，被联合国粮农组织定为向世界各国推荐的养殖对象。中国为罗非鱼养殖的主要国家，罗非鱼养殖产量达到每年120万吨，占世界罗非鱼总产量的近50%。但近年来，由于养殖密度高、养殖环境恶化等原因，养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致养殖罗非鱼的大量死亡，造成巨大的经济损失并威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。本研究分析了无乳链球菌攻毒前后尼罗罗非鱼的转录组与数字基因表达谱（Digital Gene Expression, DGE）以探究细菌感染造成的罗非鱼转录组变化，进而选定了重要免疫受体基因Siglecs进行克隆以及序列分析和组织表达研究。这些研究将有助于加深认识罗非鱼抵御病原菌入侵的免疫应答机制，为制定合理有效的罗非鱼链球菌病防控措施以及罗非鱼养殖业的可持续健康发展提供科学依据。1.受无乳链球菌感染的尼罗罗非鱼转录组与数字基因表达谱分析本研究应用Illumina RNA-seq技术进行尼罗罗非鱼转录组研究，经SOAPdenovo软件拼接组装，最终得到82,799Unigenes (平均大小:618bp)。Unigenes通过与Nr, Swissprot, COG (Cluster of OrthologousGroups of proteins), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)以及GO (Gene ontology)数据库进行BlastX比对，得到功能注释。以此转录组拼接Unigenes作为参考序列，结合DGE技术，我们对无乳链球菌攻毒前后的尼罗罗非鱼转录组变化进行研究。结果得到774条表达显著上调的Unigenes以及625条表达显著下调的Unigenes，其中，293个差异表达基因能够注释到181条信号通路中，包括17条免疫相关的信号通路（涉及65个差异表达基因）。另外，我们还对Toll-likereceptor信号通路中的6个差异表达的基因进行了实时荧光定量PCR检测，结果验证了DGE分析的可靠性。本研究得到的大量转录组组装序列丰富了罗非鱼基因序列资源，得到的差异表达基因及其相关通路分析为进一步了解罗非鱼抗链球菌感染机制以及其他免疫相关研究提供了宝贵资源。2.尼罗罗非鱼Siglec基因的克隆与组织表达分析克隆得到尼罗罗非鱼Siglec-1和Siglec-14基因。Siglec-1基因的ORF为1350bp，编码氨基酸449个。蛋白初级结构预测结果显示，Siglec-1具有信号肽1个，Ig-like结构域3个，跨膜结构域1个以及胞质区ITIM结构域1个。在系统进化树中，鱼类的Siglec-1聚为一支，哺乳类的则聚为另一支。Siglec-14基因的ORF为921bp，编码氨基酸306个。蛋白初级结构预测结果显示，Siglec-14具有信号肽1个，Ig-like结构域2个，跨膜结构域1个。实时荧光定量PCR分析结果显示，Siglec-1和Siglec-14均在尼罗罗非鱼各组织中广泛表达，其中，表达量最高的组织都是脾脏，其次是鳃和心脏，肝脏中表达量最低。本研究将为下一步进行无乳链球菌与尼罗罗非鱼Siglecs基因互作的相关研究奠定基础。

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大口黑鲈Dmrt1基因的克隆与表达分析

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作者：闫宁宁上海海洋大学

学位级别：硕士

大口黑鲈(Micropterus salmoides)俗称加州鲈,隶属鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Centrarchidae)、黑鲈属(Micropterus),自然分布于美国、加拿大等淡水水域,是北美重要的游钓鱼类。大口黑鲈于20世纪80年代引进中国,由于其肉质鲜嫩且无... 详细信息

大口黑鲈(Micropterus salmoides)俗称加州鲈,隶属鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Centrarchidae)、黑鲈属(Micropterus),自然分布于美国、加拿大等淡水水域,是北美重要的游钓鱼类。大口黑鲈于20世纪80年代引进中国,由于其肉质鲜嫩且无肌间刺,广温性、生长快及易捕捞等优点,已成为我国重要的淡水养殖品种之一。目前对于大口黑鲈性别决定与性腺分化发育机制了解甚少。Dmrt1基因在多种无脊椎动物和脊椎动物性别决定和分化过程起着重要的作用,是此过程一个重要的转录因子,也是目前已知的在鱼类中最为保守的一个与性别决定有关的基因。本研究基于大口黑鲈转录谱数据,展开大口黑鲈Dmrt1基因的研究,分析其基因结构与功能、预测蛋白结构与功能、了解基因表达情况以及表达位置,为深入开展其在性别决定与分化中的作用研究奠定基础。主要研究内容如下:1.大口黑鲈Dmrt1基因克隆与序列分析在大口黑鲈基因组三代测序数据和性腺转录谱数据中筛选候选基因Dmrt1,分别获得51688 bp的Dmrt1 genomic序列和7011 bp的Dmrt1 cDNA序列。根据此测序结果设计引物进行扩增。对Dmrt1 genomic序列的扩增共得到5段包含有外显子和内含子的序列,其中获得的Dmrt1 5’侧翼区长1517 bp,3’侧翼区长1927 bp。经过多种软件分析顺式作用元件及调控结合位点,其中包括多种性别相关因子以及基因表达调控因子,如转录激活蛋白AP-1、特化蛋白Sp1、性别相关因子Sox/SRY、DM结构域、雌激素相关受体ERR等。对Dmrt1 cDNA序列的扩增共获得cDNA序列6415 bp,含有完整的CDS,在所获得的序列中包含开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)900 bp,5’非翻译区18 bp,3’非翻译区序列5497 bp,经分析ORF编码299个氨基酸。NCBI比对后发现这一基因与其它物种的Dmrt1基因有较高的相似度,如:与黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)和欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)同源性为89%和88%。且含有与其它物种Dmrt1基因同样的保守功能区DM结构域。因此可以确定该基因为大口黑鲈的Dmrt1基因。将其与其它物种序列进行同源性比对发现,该基因与多个物种的Dmrt1具有较高的同源性,且根据NJ进化树可知,此基因在进化过程中非常保守。使用多个在线生物学软件对蛋白结构进行预测,推测其为亲水性蛋白,不具有跨膜区,且预测其为核内蛋白的可能性最大,其蛋白三级结构预测结果与果蝇Dsx的DM三级结构相似,都可能与锌离子结合,发挥生物学功能。2.大口黑鲈Dmrt1基因表达分析通过半定量与荧光实时定量PCR对大口黑鲈不同发育阶段,包括受精卵、出膜前胚胎不同发育时期、出膜后3 d0 d的仔鱼、成熟雌雄个体的8种不同组织(心、肝、脑、肌、肠、性腺、鳃、肾),以及3个不同发育时期个体(3月龄、10月龄与14月龄)的精巢、卵巢Dmrt1基因的表达情况进行分析,结果显示大口黑鲈在胚胎时期未检测到Dmrt1的表达,直到出膜40 d才开始检测到Dmrt1的表达。而在成熟个体不同组织中,精巢内的表达量最高,在其它组织中都仅有极微弱的表达。在不同时期的雌雄个体性腺中Dmrt1基因的表达也出现性别二态性,在雄鱼的精巢中Dmrt1为高表达,而在雌鱼的卵巢中表达量很低,且随着卵巢的成熟表达量逐渐下降,这正与精巢中的表达情况相反。结果说明在大口黑鲈中,Dmrt1基因主要与雄性性腺的分化与功能有关。3.大口黑鲈性腺组织学观察及原位表达分析使用地高辛标记的RNA探针对达到性成熟雌雄鱼性腺进行mRNA原位杂交,经NBT显色后显示在早期卵母细胞中有阳性信号,而在成熟卵母细胞中则未检测到;在精巢的各类精细胞(如初级精母细胞、次级精母细胞和成熟精子)中都有较强的阳性信号,且信号主要集中在以上各种类型细胞的核区。这一研究结果表明,Dmrt1主要是在雄性的精巢中发挥作用。本研究确定了Dmrt1为大口黑鲈性别二态性表达的基因,推测在性别分化与性腺发育过程中起关键作用。本研究结果一方面可为大口黑鲈性别决定与性别分化分子机制的深入研究奠定基础;另一方面,通过探索该基因在雌雄大口黑鲈的表达差异,可为生产单性苗种提供理论依据。

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鲈亚目养殖鱼类的系统进化及宝石鲈群体遗传多样性研究

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作者：赵立祥上海海洋大学

学位级别：硕士

宝石鲈(Scortum barcoo)学名高体革鯻,隶属于鯻科(Teraponidae)、革鯻属(Scortum),自然分布于澳洲河流中,是澳大利亚重要的游钓鱼类,上世纪90年代被引进到中国,现正成为中国淡水工业化养殖与池塘养殖的品种。本研究利用线粒体基因组分... 详细信息

宝石鲈(Scortum barcoo)学名高体革鯻,隶属于鯻科(Teraponidae)、革鯻属(Scortum),自然分布于澳洲河流中,是澳大利亚重要的游钓鱼类,上世纪90年代被引进到中国,现正成为中国淡水工业化养殖与池塘养殖的品种。本研究利用线粒体基因组分析了宝石鲈的系统进化地位,并用微卫星分子标记及线粒体控制区序列片段分析宝石鲈4个养殖群体的遗传多样性和遗传分化状况。以下是本研究的主要内容:1.淡水黑鲷线粒体基因组及与鲈亚目鱼类系统进化关系分析为进一步从分子水平探讨淡水黑鲷及鲈亚目淡水主要养殖鱼类的系统进化关系,本研究第一章对淡水黑鲷线粒体基因组全序列进行了扩增、测序,并利用GenBank上登录的鲈亚目中的鯻科、鮨科与太阳鱼科共19种鱼类的线粒体基因组信息分析其系统进化关系。淡水黑鲷线粒体基因组大小为16 770 bp,其基因组编码了37个基因(包括13个蛋白、2个rRNA与22个tRNA编码基因)另外还有一个非编码控制区D-loop;编码基因中除了少数几个基因(ND6和8个tRNA 9个编码基因)由轻链(L链)编码外,大部分基因在重链(H链)编码。淡水黑鲷线粒体所有编码基因以及非编码控制区的排列次序与编码位置与绝大部分脊椎动物的相同。通过邻接法、最大简约法及贝叶斯法分别根据这些鱼类的线粒体基因组,细胞色素B、CO I和12S rRNA等6个单基因序列进行进化关系分析。基于mtDNA与单个基因序列的分析结果基本一致。在进化树中,鯻科、太阳鱼科的鱼类各分聚一支,鮨科鱼类则分成两支,其中花鲈属鱼类和鳜属鱼类各分成一支。此外,本研究的进化关系分析结果认为太阳鱼科的大口黑鲈南方亚种与北方亚种应是二个独立的种,而鮨科中的鳜属鱼类应为独立的科。本研究获得的淡水黑鲷线粒体基因组序列,可对其种群遗传多样性及种质资源研究提供分子基础,同时鲈亚目淡水养殖鱼类的进化关系分析可为其杂交育种等研究提供分子依据。2.宝石鲈养殖群体遗传多样性分析扩增4个群体共96个宝石鲈个体的线粒体D-loop序列片段(598bp),测序结果显示D-loop序列有14个多态性位点,共定义了8个单倍型,其中单倍型Hap 1为中山(ZS)和佛山2个群体(FS 1和FS 2)的共享单倍型,Hap 3为番禺(PY)和佛山2个群体(FS 1和FS 2)的共享单倍型。根据线粒体D-loop序列分析遗传多样性,结果显示4个群体的单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数分别为0.0000-0.5435、0.00000-0.00176,表明4个群体的遗传多样性水平均较低。群体间的遗传分化分析显示,宝石鲈4个群体间处于较高的遗传分化水平(F=0.40345>0.2),有59.66%的遗传变异来自群体内部。采用荧光标记SSR引物对96个样本进行PCR扩增与分型,结果表明本实验选用的11个微卫星位点中除了L2052外,其它位点均具有中等以上的多态性,多态信息含量(PIC)为0.261-0.609>0.25,期望杂合度(H)=0.396-0.516,显示各群体遗传多样性处于中低水平。遗传分化分析显示各群体间的遗传分化处于低水平(F=0.0445<0.05),60.72%的遗传变异来自群体内部。遗传距离分析显示,4个群体的亲缘关系都非常近,其中番禺和中山2个群体间的遗传距离最近为0.013,而遗传距离最远的番禺群体和佛山群体2也仅为0.047。根据遗传距离构建的UPGMA进化树来看,4个宝石鲈养殖群体中番禺(PY)和中山(ZS)2个养殖群体群体聚为一支,佛山的两个养殖群体(FS1、FS2)聚为一支。本研究线粒体D-loop序列和微卫星标记2种方法进行遗传多样性和遗传分化分析获得的结果略有不同,基于线粒体D-loop序列分析显示中山群体无遗传多样性且群体间的遗传分化水平较高,而SSR分子标记分析中显示中山群体与其它3个群体均具有较低的遗传分化水平但群体间的遗传分化水平较低。2种分析方法均显示所分析的宝石鲈4个群体的遗传多样性较低,而且它们间的亲缘关系较近,因此有必要引进宝石鲈原种以丰富国内宝石鲈养殖群体的遗传多样性。

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翘嘴鳜生长相关分子标记的挖掘及其与生长的关联分析和在系谱鉴定中的应用

翘嘴鳜生长相关分子标记的挖掘及其与生长的关联分析和在系谱鉴定...

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作者：孙海林上海海洋大学

学位级别：硕士

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要淡水经济鱼类。但随着近40年的人工繁殖,其自然种质资源和养殖性状有所下降,呈现生长速率下降及抗病性减弱等问题,严重影响到其养殖效益和产品的质量安全,因此有必要开展相关种质资源保护及优良品... 详细信息

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要淡水经济鱼类。但随着近40年的人工繁殖,其自然种质资源和养殖性状有所下降,呈现生长速率下降及抗病性减弱等问题,严重影响到其养殖效益和产品的质量安全,因此有必要开展相关种质资源保护及优良品种的选育以保障翘嘴鳜养殖业的健康可持续发展。本研究根据实验室前期遗传连锁图谱构建获得的重要生长数量性状位点(QTL),对翘嘴鳜进行生长相关分子标记挖掘;结合良种选育工作的需要,根据翘嘴鳜生长差异转录组进行SSR新标记的开发,并用于翘嘴鳜选育群体的遗传多样性分析以及选育子代F2的亲权鉴定。主要内容如下:1、鳜生长相关QTL的挖掘—生长激素(GH)基因多态性及生长关联分析性状相关分子标记的筛选,可应用于良种选育过程以提高选育效率。前期研究中本课题组采用dd RAD-Seq技术构建了首张翘嘴鳜高密度遗传连锁图谱,获得与生长显著相关的11个数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)。本研究将此11个位点在NCBI数据库中进行比对,发现其中一个QTL位于生长激素(Growth hormone,GH)基因上。为探讨翘嘴鳜GH基因多态性及其与生长的相关性,本研究克隆了翘嘴鳜GH基因全序列,在小群体中采用直接测序法检测其多态性,共获得32个单核苷酸多态性(SNP)和1个“AG”简单序列重复(SSR)。选取其中的8个SNPs(G18)和1个SSR(GH-AG),于翘嘴鳜大群体中进行基因分型和生长性状的关联分析。结果显示,G13和GH-AG 4个位点与翘嘴鳜的生长性状显著关联(PD3>D2>D4,且D1极显著高于D4(P0.5)。9个SSR位点在820尾亲本和子代中共检测到64个等位基因,平均PIC为0.6604。对F1代亲本及其子代进行遗传多样性分析,发现亲本和子代群体的遗传多样性均较高(He>0.5)。F2子代8个混合家系中,以3、8号混合家系的遗传多样性最高(He分别为0.614和0.618)。利用上述9个微卫星位点对F2子代8个混合家系组合进行亲子鉴定,结果显示当置信度为80%时,对应于组合1、3、4、5、6、7、8、10号

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南方养殖草鱼呼肠孤病毒分子特性的分析及VP4重组蛋白免疫效果初步研究

南方养殖草鱼呼肠孤病毒分子特性的分析及VP4重组蛋白免疫效果初...

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作者：迟妍妍上海海洋大学

学位级别：硕士

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的重要品种,其产量约占淡水养殖总产量的20%,在我国农业经济中具有重要的意义。但是其养殖期间易发生出血病,导致高死亡率,常造成草鱼养殖业的巨大损失。本实验室最近在广东养殖草鱼患出... 详细信息

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的重要品种,其产量约占淡水养殖总产量的20%,在我国农业经济中具有重要的意义。但是其养殖期间易发生出血病,导致高死亡率,常造成草鱼养殖业的巨大损失。本实验室最近在广东养殖草鱼患出血病病鱼体上分离到一株病毒株(暂命名为GCRV-GD108),人工感染实验显示该毒株对草鱼具有强致病性。病毒全基因组测序的结果显示该株与已报道的GCRV以及其它水生呼肠孤病毒属已知种的序列存在较大差异。本研究在此基础上检测南方草鱼主养区病毒株的分子特性,并建立双重PCR检测方法,通过一次PCR反应鉴别病毒株属于GCRV或GCRV-GD108。同时制备外衣壳蛋白VP4的重组蛋白,开展重组蛋白免疫原性与保护作用分析。本研究为草鱼病毒性出血病的有效防控奠定基础。 1.南方各毒株样品的分子特性分析根据本实验室前期研究所获得的GCRV-GD108株的序列,设计了针对每个节段的扩增引物,RT-PCR方法扩增采自广东、福建和湖南等地的病毒株。结果显示各样品相互间、样品与GCRV-GD108株间11个节段序列均具有较高的同源性。各样品序列两两间的相似性为95.2%9.4%,各样品与GCRV-GD108株序列的相似性在95.0%99.8%间;样品间同源性最高的为S9片段,L3片段的同源性最低,各样品M4片段间的差异较大。本研究说明目前南方多个地区的草鱼出血病病毒均具有与GCRV-GD108株相似的分子特征,提示GCRV-GD108株是南方省市的主要代表性流行毒株。此外,还进行了病毒感染组织特异性的分析,结果显示各组织样品均能检测到特异条带,说明各组织中均感染有病毒。 2.双重PCR扩增方法的建立在上述检测基础上筛选合适引物对,以健康草鱼、GCRV标准株以及GCRV-GD108株基因组RNA为模板,反转录所获得的cDNA进行双重PCR扩增,结果显示健康草鱼无特异条带产生,GCRV标准株样品均有450 bp左右的条带,而GCRV-GD108株则出现了与各对引物预期大小相符的条带。同时进行了灵敏性分析,结果显示可扩增到浓度为5.07×10-9μg/ml的模板。说明该方法具有较高的灵敏性与特异性,通过一次PCR反应可鉴别所感染的病毒属于GCRV或GCRV-GD108株,该方法适用于生产上大批量草鱼样品的检测,可在短时间内确定感染病毒的分子特性,以便采取相应的防控措施。 ***-GD108 M6基因的克隆、抗原性分析及重组蛋白制备本研究克隆GCRV-GD108的M6节段。M6基因全长2028bp,含一个开放阅读框(ORF)1716bp。M6基因的编码蛋白VP4与GenBank上已登录的GCRV标准株VP4序列同源性为47.4%。Blast分析显示VP4蛋白具有Reovirus M2超家族的主要结构域(Reovirus major virion structural protein Mu-1/Mu-1C (M2) superfamily),该蛋白家族在病毒的结构和功能的行使上起重要作用,是病毒的外衣壳蛋白,在病毒的膜穿透过程中起作用,推测GCRV-GD108 VP4具有相似的功能。用DNAstar软件预测M6抗原区,显示其具有28个抗原表位,提示VP4具有较强的抗原性。本研究进一步采用基因工程技术制备重组重组VP4蛋白。根据M6的ORF序列设计引物,将VP4编码序列克隆至表达载体中构建重组原核表达载体pET32a-VP4,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量大小为87kDa的His-VP4融合蛋白。本研究为下一步开展GCRV-108的致病性和感染机制研究,并有效防止草鱼出血病爆发奠定基础。 4.重组蛋白免疫原性与保护作用评价重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔制备多克隆抗体,经Elisa检测,抗体效价达到1:64000以上,说明重组蛋白VP4具有较好的免疫原性。用此重组蛋白免疫草鱼,受免鱼免疫14 d后进行人工攻毒,结果表明重组VP4蛋白对病毒感染有较好的保护效果,3μg/g注射量的保护率可达到82%。

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尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的克隆、表达与转植的初步研究

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作者：吴芳上海海洋大学

学位级别：硕士

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)，为联合国粮农组织向世界各国推荐的养殖对象，现已成为中国重要的养殖鱼类品种。但近年来养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致罗非鱼的大量死亡，威胁... 详细信息

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)，为联合国粮农组织向世界各国推荐的养殖对象，现已成为中国重要的养殖鱼类品种。但近年来养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致罗非鱼的大量死亡，威胁着我国罗非鱼养殖业的健康发展，因此很有必要开展罗非鱼免疫防御机制的研究。γ-干扰素是调控天然免疫和细胞免疫的一种重要的细胞因子，除了具有抗病毒作用外，干扰素还参与到其他重要的生理反应中，如调节细胞的生长、分化、凋亡及免疫反应等，近年的研究发现干扰素中的γ-干扰素还具有显著的抗菌作用。本研究克隆了尼罗罗非鱼γ-干扰素基因，实时定量PCR检测了其在无乳链球菌感染前后各组织和器官中的表达，以了解γ-干扰素基因在尼罗罗非鱼免疫防御过程中的作用;同时以斑马鱼作为转基因研究模型，评估金鱼Tgf2转座子系统在转基因鱼研制上应用的可行性，并应用于构建转基因罗非鱼。主要研究内容如下：1.尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的克隆与表达特性分析。本研究从尼罗罗非鱼脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的cDNA，其大小为690bp，开放阅读框为621bp，推测编码206个氨基酸。生物信息学分析表明，尼罗罗非鱼γ-干扰素分子包含1个信号肽和1个核定位信号。其二级结构复杂，含有10个α-螺旋、13个β-折叠，具有较强的亲水性。同源性分析显示，其与斜带石斑鱼γ-干扰素相似性最高（61.5%）。实时荧光定量PCR检测正常尼罗罗非鱼个体γ-干扰素基因在不同组织中的表达，结果表明该基因在脾脏中表达量最高，其次是肠、鳃和肾脏，在心脏、肌肉和皮肤组织中的表达量则较低。感染无乳链球菌后，尼罗罗非鱼γ-干扰素基因在脾脏、皮肤、肾和鳃中的表达均显著上调。推测尼罗罗非鱼γ-干扰素参与鱼体对病原菌的防御过程，在免疫反应中发挥重要作用。同时应用原核表达系统制备尼罗罗非鱼γ-干扰素重组融合蛋白，为进一步了解其功能奠定基础。2. Tgf2转座系统在转RFP基因斑马鱼上的应用。本研究利用近年开发的金鱼转座子系统进行转基因斑马鱼的研制，探讨其在转基因鱼上应用的可行性。通过PCR手段，改造转座子供体质粒pTgf2-EF1α-eGFP，将肌球蛋白轻链2启动子(mylz2)与红色荧光蛋白基因(RFP)定向插入其中，构建红色荧光蛋白基因肌肉组织特异性表达供体质粒pTgf2-Mylz2-RFP。通过显微注射，将转座子供体质粒与转座酶mRNA共注射于斑马鱼受精卵中，共注射受精卵972粒，仔鱼出膜803尾，其中携带外源基因的仔鱼615尾，阳性率为76.6%。转红色荧光蛋白基因斑马鱼的F0代培育至性成熟，将10尾F0代斑马鱼与野生型斑马鱼配对繁殖，其中1个组合产生了体表呈现均匀红色荧光的F1个体，RFP在F0代的整合率为10%。将红色荧光F1个体培育至性成熟并与野生型鱼配对繁殖，F2代的阳性个体占69%。本研究结果说明由Tgf2转座子介导的转基因技术,可有效提高目的基因的转植效率与整合效率，在转基因鱼构建以及相关研究中具有开发应用前景。3.尼罗罗非鱼γ-干扰素基因转基因元件的构建及在斑马鱼中的转植。定向改造金鱼Tgf2转座子供体质粒pTgf2-hsp70-eGFP，用尼罗罗非鱼γ-干扰素基因替换GFP基因，构建由hsp70启动子驱动的γ-干扰素基因Tgf2转座子供体质粒pTgf2-hsp70-γIFN。通过显微注射，将转座子供体质粒与转座酶mRNA共注射于斑马鱼受精卵中，共注射受精卵3000粒，仔鱼出膜1480粒。转基因斑马鱼F0代培育至性成熟后，与野生型鱼配对繁殖，首批8尾转基因鱼中有2尾获得F1阳性个体，可遗传率为25%。本研究为进一步分析转γ-干扰素基因斑马鱼的抗病力以及开展转基因抗病罗非鱼的构建奠定基础。

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翘嘴鳜microRNA转录组及与生长发育相关miRNA的鉴定与分析

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作者：王博上海海洋大学

学位级别：硕士

翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）隶属鲈形目（Perciformes）、鳜亚科（Sinipercinae）、鳜属（Siniperca）,是我国淡水优质鱼类。至2014年,全国鳜鱼产量已达293 853吨,广东、江西、安徽等地区是主要养殖省份。养殖密度的增加导致水体生态... 详细信息

翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）隶属鲈形目（Perciformes）、鳜亚科（Sinipercinae）、鳜属（Siniperca）,是我国淡水优质鱼类。至2014年,全国鳜鱼产量已达293 853吨,广东、江西、安徽等地区是主要养殖省份。养殖密度的增加导致水体生态环境恶化;长期人工繁殖忽视亲本选育,导致鳜鱼种质退化,出现生长速度下降及抗病力降低的问题。因此,选育生长快的品种对鳜鱼养殖至关重要。体重是衡量鱼体生长发育的重要指标之一。骨骼肌占活鱼体重的30%0%,是鱼体的主要组成部分,也是研究鱼类生长的重要材料。大多数鱼类在出生后通过肌纤维的不断增生和肥大两个过程进行肌肉生长,肌肉的生长发育过程被生长因子、调控蛋白、miRNA、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）通路、Wnt/β-catenin信号通路等多水平精确调控。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性、长度约22 nt非编码小RNA,主要通过种子序列与靶基因mRNA的3’端非翻译区（3’-UTR）结合调控基因的表达水平从而参与生物体的生长与发育、疾病等多种生理过程。在本研究中,我们以生长存在显著差异的慢长组、快长组翘嘴鳜肌肉为材料,采用Illumina HiSeq深度测序技术、生物信息学及实验方法,初步筛选与生长发育相关的miRNA,以期为鳜鱼分子选育种提供候选基因。主要研究内容如下:1.翘嘴鳜miRNA的鉴定及保守miRNA碱基编辑情况统计本研究通过HiSeq高通量测序对慢长组和快长组进行miRNA转录组测序,组装、拼接后分别获得11241781和11410753条干净序列。与miRBase数据库比对,一共获得翘嘴鳜保守miRNA 433个,其中快长组有413个,慢长组410个。统计已知miRNA碱基编辑情况,结果显示在快长组、慢长组中分别发生2336、2143处碱基编辑,其中出现次数较高的编辑类型是G-to-U与U-to-C,出现次数较低的编辑类型是C-to-U与C-to-A。miRNA编辑不仅增加了miRNA转录组的功能多样性,也是转录组进化稳定的特征。这些数据的获得与分析丰富了鳜鱼转录组信息。2.快长与慢长组差异表达miRNAs的鉴定与q-PCR验证采用Expdiff方法在快长与慢长组间鉴定出8个差异miRNAs,进一步通过实时荧光定量qRT-PCR试验验证这些差异表达的miRNAs。其中miR-122、miR-192、miR-200b-5p、mi R-451在慢长组中显著上调;而let-7j-5p、mi R-499-5p、miR-10b-3p、miR-204-3p则在快长组中显著上调。经实时荧光定量RT-PCR方法验证:miR-122、mi R-192、miR-451在慢长组中高表达,它们在两组间均存在显著差异（p<0.05）,与测序结果一致,但miR-200b-5p则为显著低表达;验证结果显示let-7j-5p在快长组中也为高表达,但miR-499-5p、miR-10b-3p却为低表达,其中let-7j-5p和miR-499-5p在两组间均为显著差异,而miR-10b-3p则为极显著差异;miR-204-3p在两组间则差异不显著。这一结果为进一步了解miRNA对翘嘴鳜生长发育的调控提供基础。3.差异表达miRNAs的靶基因预测及KEGG通路注释利用软件RNAhybrid和Targetscan对差异miRNA进行靶基因预测,将靶基因进行KEGG Pathway显著性富集分析。取两个软件预测结果的交集,获得36 065个miRNA-靶基因mRNA,分析miRNA-靶基因交互作用的遗传多态性的数据,以期对翘嘴鳜分子育种提供有用信息。mRNA经KEGG富集分析可注释到307个信号通路,这些通路涉及生长、代谢、发育等发面。其中Wnt信号通路是一个重要的鱼类骨骼肌信号通路。***-PCR分析翘嘴鳜miR-192的胚胎表达模式miR-192是上述研究中发现的差异表达miRNA之一,通过实时荧光定量qRT-PCR对其胚胎表达模式进行分析,结果发现miR-192为母源性表达基因,在未受精的鱼卵中能检测到表达,在受精卵到开口期表达量呈现先下降后上升趋势:在未受精卵、受精卵和多细胞期都有大量表达,之后在囊胚期其表达量急剧下降;从原肠胚期到肌肉效应期仅检测到其极低表达量;而从出膜期到开口期表达急剧上升。miR-192可能在翘嘴鳜胚胎的分化发育过程起重要作用。

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草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的功能及免疫原性分析

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作者：王杭军上海海洋大学

学位级别：硕士

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水主要养殖品种，是“四大家鱼”之一。其饲养成本低，养殖范围广，但养殖过程病害较多，其中草鱼出血病可引起草鱼大批死亡，草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90%，给养殖生产带来了巨大的损... 详细信息

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国淡水主要养殖品种，是“四大家鱼”之一。其饲养成本低，养殖范围广，但养殖过程病害较多，其中草鱼出血病可引起草鱼大批死亡，草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90%，给养殖生产带来了巨大的损失。引起草鱼病毒性出血病的病毒为草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV），隶属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus，AQRV）。根据本实验室已获得的草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108株全序列，本研究对其编码VP5蛋白的M5基因序列进行了分析，同时构建其原核表达载体，制备重组VP5蛋白，检测了其NTPase(核苷三磷酸酶，nucleoside triphosphatases)活性，并对其免疫原性进行了初步研究。 1.草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株M5基因序列分析 GCRV-GD108的M5基因全长2230bp，含一个开放阅读框(ORF)2178bp。Blast结果显示M5基因编码分子量大小约80ku的蛋白。氨基酸序列分析表明，该蛋白与水生呼肠孤病毒属中多个病毒株的核衣壳蛋白VP5的氨基酸同源性为24%-25%;与哺乳动物正呼肠孤病毒（Mammalian reovirus，MRV）的μ2及禽呼肠孤病毒（Avianreovirus，ARV）的MμA也有较高的同源性（20%）。且该蛋白包含一段μ2样NTP结合保守区域，因此可确定GCRV-GD108株M5基因编码的蛋白为VP5，与MRV的μ2和ARV的μA蛋白同源。 2. GCRV-GD108株M5基因原核表达载体的构建及表达以根据已获得的M5基因cDNA序列，分别设计合成带特定酶切位点的特异引物，进行PCR扩增;通过酶切与连接，构建了两种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5，分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化，确定最适表达体系。SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定。结果显示所构建的两种VP5蛋白原核表达载体，均在大肠杆菌中成功地表达了分子量大小与预期相符（约为80ku）的重组蛋白，且表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎，离心收集包涵体。包涵体通过变性、透析与复性，获得纯化的重组蛋白，其中pET30c-M5/BL21(DE3)工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5%，纯化后获得了高纯度的重组蛋白（>95%）。比较两种表达载体的表达结果，认为表达载体pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白。 3.重组GCRV-GD108株VP5蛋白NTPase活性及免疫原性分析重组蛋白经纯化后，进行ATPase活性测定，通过钼酸铵比色法分析显示重组VP5蛋白具有一定的ATPase活性，活力为0.693μmolPi/mgprot/hour。同时用重组蛋白免疫草鱼，采用荧光定量PCR方法分析诱导前后草鱼头肾组织IgM基因表达水平的变化，结果显示免疫组IgM mRNA的水平均高于对照组。Elisa分析VP5蛋白诱导产生的抗体效价，结果显示呈现阳性反应，说明重组蛋白能诱导产生特异性抗体。但对草鱼的保护性实验结果显示，免疫组几乎没有保护效果。本研究结果说明VP5应可在病毒内部RNA转录过程起作用，同时该蛋白具有免疫原性，但诱导产生的抗体未能为草鱼提供抗病毒保护。

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罗非鱼Lysozyme-C3基因在斑马鱼中的转植研究

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作者：瞿兰上海海洋大学

学位级别：硕士

罗非鱼隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)，是我国重要养殖鱼类之一。近年广东、海南、福建和广西等地区养殖罗非鱼爆发链球病，使我国罗非鱼养殖业的健康发展受到了严重威胁，因此提高罗非鱼的抗病能... 详细信息

罗非鱼隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)，是我国重要养殖鱼类之一。近年广东、海南、福建和广西等地区养殖罗非鱼爆发链球病，使我国罗非鱼养殖业的健康发展受到了严重威胁，因此提高罗非鱼的抗病能力成为迫切需要解决的问题。转基因技术为鱼类育种开辟了新的途径。本研究通过比较、筛选出对无乳链球菌具有较强溶菌作用的罗非鱼Lysozyme-C3基因，利用本实验室已分离到的诱导型罗非鱼Hsp70基因启动子，构建了罗非鱼Lysozyme-C3基因表达载体并进行显微注射，观察转植基因在斑马鱼中的表达情况，为转基因培育抗病罗非鱼的研究奠定基础。主要研究内容如下：1．几种鱼虾溶菌酶重组蛋白溶菌活性的比较。采用基因工程重组技术制备了罗非鱼3种C型溶菌酶的重组蛋白，并应用比浊法比较了它们与草鱼C型、G型溶菌酶、斑节对虾C型溶菌酶重组蛋白对无乳链球菌、嗜水气单胞菌等8种细菌的溶菌作用。结果显示6种重组溶菌酶对8种菌均具有溶菌活性，但是溶菌活力强弱不一。罗非鱼C3溶菌酶对革兰氏阳性菌无乳链球菌的溶菌作用最强，草鱼C型与G型溶菌酶次之;所有重组溶菌酶对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌均具较强的溶菌活性。与斑节对虾C型溶菌酶、草鱼C型与G型溶菌酶相比，罗非鱼的C型溶菌酶对嗜水气单胞菌具有较强的溶菌作用，且以C1的溶菌活性最强。2．应用金鱼Tgf2转座酶系统进行Lysozyme-C3基因的转植研究。金鱼Tgf2转座子是近年在金鱼上发现的具有转座活性的转座子。本实验室前期研究中，构建了带罗非鱼Hsp70启动子的转座子供体质粒pTgf2-Hsp70-eGFP并证实该启动子具有强诱导活性。本实验利用高保真酶PCR扩增罗非鱼Lysozyme-C3基因开放阅读框并替换该供体质粒中的eGFP基因，获得pTgf2-Hsp70-C3表达载体。然后设计引物扩增此载体上的Hsp70-C3-SV40片段，并将其插入pTgf2-Hsp70-eGFP载体的eGFP之后，从而成功构建了用于斑马鱼转基因的双基因表达载体pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3。3．转Lysozyme-C3基因斑马鱼的获得与检测。采用显微注射方法将携带Hsp70启动子、eGFP基因和C3基因的转座子供体质粒pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3和编码转座酶的mRNA共注射到斑马鱼的受精卵中。注射12h后37℃热激处理1h，28℃孵育，12h后使用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光表达情况，并挑选出呈绿色荧光的斑马鱼阳性个体。共有580个胚胎孵化出膜，其中有261个胚胎有绿色荧光，荧光率达45%。采用RT-PCR在转基因斑马鱼F1代肝脏、肌肉、肠道、皮肤中均可检测到eGFP基因mRNA，但仅在肝脏中检测到Lysozyme-C3基因mRNA。采用Western blot技术在转基因斑马鱼F1代肝脏中均可检测到eGFP和Lysozyme-C3蛋白条带。分析结果说明，在RNA水平和蛋白水平均能检测到转植基因的表达，证实转植的罗非鱼溶菌酶基因通过转基因首代遗传到F1代。进一步比较野生型和转基因斑马鱼F1代肌肉和肝脏溶菌酶对无乳链球菌的溶菌活性，发现转基因斑马鱼具有较强的溶菌活性，提示转基因斑马鱼可能比野生型斑马鱼具有更强的抵御无乳链球菌感染的能力。本研究结果为下一步开展转基因培育抗病罗非鱼的研究奠定了基础。

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罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及重组表面免疫原性蛋白His-Sip的免疫效果初步研究

罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及重组表面免疫原性蛋白His-Sip的...

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作者：黎炯上海海洋大学

学位级别：硕士

罗非鱼（Tilapia）隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科（Cichlidae）、罗非鱼属（亦称丽鲷科,丽鲷属）。由于罗非鱼具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点,目前已成为世界性主要养殖鱼类,中国罗非鱼养殖产量占世界的一半以上。抗... 详细信息

罗非鱼（Tilapia）隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科（Cichlidae）、罗非鱼属（亦称丽鲷科,丽鲷属）。由于罗非鱼具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点,目前已成为世界性主要养殖鱼类,中国罗非鱼养殖产量占世界的一半以上。抗病力强是罗非鱼被广泛养殖的主要因素之一。但随着世界各地罗非鱼链球菌病的出现,一直以来认为罗非鱼具有强抗病力、不易患病的观点已受到挑战。最近几年我国也有罗非鱼链球菌病的发生,但仅局限于小范围内流行,所导致的死亡率为20-30%。2009年广东与海南省多个罗非鱼主养区发生暴发病,与往年的发病情况比较,本次病害发生的范围较广、罗非鱼受感染率与死亡率均较高,个别发病率超过50%,发病鱼死亡率超过95%。本实验室研究人员赶赴广东与海南省各罗非鱼主养区,采集发病鱼样本,开展了相关研究。本论文内容包括病原菌的分离与鉴定、药物敏感性试验;双重PCR法鉴定无乳链球菌与海豚链球菌;致病菌分子血清型的鉴定;重组表面免疫原性蛋白Sip的制备及免疫原性分析等。研究结果对罗非鱼链球菌病的有效防控、促进罗非鱼养殖业的健康发展具有重要意义。1病原菌的分离与鉴定及药物敏感性分析从各地患病罗非鱼体表病灶上共分离纯化了二十多株优势菌,回归感染试验显示这些分离菌株都能感染罗非鱼且具有强毒力。挑取其中毒力最强的7株,进行形态特征和主要理化特性分析,初步鉴定为无乳链球菌（Streptococus agalactiae）。进一步对其进行分子鉴定,PCR扩增16S rRNA基因和无乳链球菌特有GBS-specific gene cfb （CAMP factor）基因的全长序列,BLAST分析显示所有菌株的16S rRNA基因与GenBank上登录的无乳链球菌的相应序列高度同源（> 99.8%）,各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源性（≥99.9%-100%）。各菌株间cfb基因序列高度同源（100%）,与已知无乳链球菌的相应序列也具有高度同源性（≥99.0%）。综合生理生化与分子鉴定结果,可判定所分离的菌株为无乳链球菌。药敏试验显示,29种抗生素中13种为敏感,7种为不敏感,9种存在菌株间的差异。2双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌方法的建立无乳链球菌和海豚链球菌是鱼类链球菌病常见的二种病原菌,所引发的病症相似,难于根据病症直接判断病原菌。本研究根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16S rRNA基因序列设计合成两对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法。用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌后可分别获得474bp和296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其它常见鱼病原菌则无特异性片段产生。该方法具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng·μL-1的无乳链球菌和3.0×10-2 ng·μL-1的海豚链球菌。该法的建立可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,为病害的有效控制提供依据。3无乳链球菌分离株分子血清型的分型采用多重PCR与单核苷酸序列多态性（SNP）分析方法,检测了无乳链球菌荚膜多糖抗原基因CPS、Alpha C蛋白基因ACP,确定了2009、2010年广东与海南各罗非鱼主养区分离到的病原菌的分子血清型,并结合多位点序列分型（MLST）分子分型方法进行进一步的分析,发现这些分离株均属ST-7型,该型在GBS数据库中未发现相应的血清型,说明这些分离株具有不同于已知的人类或动物GBS的分子特性,研究结果为进一步的流行病学研究与疫苗制备提供重要的参考。4无乳链球菌表面免疫原性蛋白Sip的基因克隆、表达及免疫原性分析表面免疫原性蛋白（Surface Immunogenic Protein,Sip）是B群链球菌（Group B streptococcus, GBS）的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。本研究采用PCR方法从本实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 （DE3）菌株。经诱导表达、SDS-Page电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼（Oreochromis niloticus, GIFT strain）以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%7%。酶联免疫吸附试验（Elisa）显示受免鱼血清对重组蛋白产生了较好的免疫应答,抗体滴度可达约1:128 000。本研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非

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