检索结果-南通市图书馆

作者：王文静西北师范大学

学位级别：硕士

教材作为最重要的教育资源,是师生进行课堂教学的重要载体。除教材正文内容外,人教版高中生物学教材还设置了形式多样、内容丰富的辅助性教学栏目,这些栏目能够激发学生的学习兴趣、训练并提高学生的逻辑思维、推理和表达等能力。“问... 详细信息

教材作为最重要的教育资源,是师生进行课堂教学的重要载体。除教材正文内容外,人教版高中生物学教材还设置了形式多样、内容丰富的辅助性教学栏目,这些栏目能够激发学生的学习兴趣、训练并提高学生的逻辑思维、推理和表达等能力。“问题探讨”栏目设置在每一节开头,以图表+资料+问题的形式呈现,内容来源于生产实践、生物科学史、生物学实验、科研成果等多方面,一般用作新课导入。本文梳理了有关教材栏目的研究文献,使用内容分析法对“问题探讨”栏目的分布、来源、构成、类型、特点和作用等几个方面进行了分析,并通过学生问卷和教师访谈对当前“问题探讨”栏目的应用现状进行调查,发现师生认同该栏目的教育价值,但其在课堂教学中的使用率不高且使用形式单一,导致这一结果的原因主要是课时紧张、有些栏目内容难以激发学生的学习兴趣、与教材内容联系不紧密、设置的问题偏难或过于简单等。结合应用现状和栏目的特点及作用,提出了使用“问题探讨”栏目开展课堂教学的教学策略,包括新课导入、课堂讨论、课堂小结、课前预习、拓展延伸和作为练习题等。基于以上提出的策略进行了教学实践,通过课堂观察和学生访谈对实践效果进行评价,发现所提策略具有一定的可行性和有效性,不仅能够拓宽学生的知识面、提高学生的课堂参与度和对生物学的学习兴趣、改善课堂教学氛围、提升学生分析和解决问题的能力,也能为一线教师使用该栏目教学提供一定的借鉴和参考。

关键词：高中生物学教材 “问题探讨”栏目教学策略实践研究

毛细管电泳法检测细胞中8-OH-dG及几种抗氧化剂活性

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毛细管电泳法检测细胞中8-OH-dG及几种抗氧化剂活性

作者：张晓煜西北师范大学

学位级别：硕士

DNA作为遗传物质是生命活动中最重要的组成部分,但易受到损伤进而对细胞乃至机体造成损害。DNA损伤中以氧化损伤为主要类型。当机体氧化与抗氧化体系失衡就会出现氧化应激,产生极为活泼的自由基且易导致细胞损伤,从而诱使疾病和衰老的... 详细信息

DNA作为遗传物质是生命活动中最重要的组成部分,但易受到损伤进而对细胞乃至机体造成损害。DNA损伤中以氧化损伤为主要类型。当机体氧化与抗氧化体系失衡就会出现氧化应激,产生极为活泼的自由基且易导致细胞损伤,从而诱使疾病和衰老的发生。而DNA是自由基特别是活性氧自由基攻击的重要靶分子之一,于是探讨灵敏的检测DNA氧化损伤的方法显得尤为重要。鉴于DNA的结构直接决定了其检测的复杂和难度,因此针对DNA氧化损伤标记物的检测就成为间接检测DNA氧化损伤程度的有效手段。而在被报道的大约20种DNA氧化损伤标志物中,8-OH-dG因易于检出等原因,被一致认为是DNA氧化损伤的重要的标志物之一。另外在分离检测方法中,异军突起的毛细管电泳成为分析化学领域一种新型的分离分析技术。它的快速和高效使得它迅速在食品、药物、法医、环境、生命科学等各个领域独树一帜。本研究致力于优化毛细管电泳法检测8-OH-dG的条件,在此基础上检测氧化胁迫及不同天然产物保护后细胞8-OH-dG含量,而达到检测细胞中8-OH-dG含量,进而反应出抗氧化剂的活性,建立一种新型检测抗氧化剂活性的有效办法。结果如下:（1）探索毛细管电泳检测8-OH-dG标准样品优化条件,结果如下:温度20℃;电压20KV;进样方式压力进样;20psi（Pounds per square inch）;进样时间20s;检测时间10min;电泳缓冲溶液为pH 9.0,10mmol/L硼酸-氢氧化钠缓冲液;样品溶剂为三蒸水。同时检测了其精确度和稳定性,误差小重复性好。（2）探索毛细管电泳检测HL-60细胞中8-OH-dG检测优化条件同标准品检测。优化了去除DNA水解酶的关键步骤,采用沸水浴5min使DNA水解酶变性,离心后达到完全沉淀已变性的蛋白的目的。不同浓度H2O2处理细胞后发现随着H2O2浓度增加,8-OH-dG含量越高,说明对DNA的氧化损伤就越大。（3）毛细管电泳检测不同抗氧化剂对HL-60细胞的保护作用,结果显示:番茄红素、槲皮素以及姜黄素均对H2O2引起的HL-60细胞中DNA的损伤有保护作用,且保护作用依次递增,其8-OH-dG的含量由为保护时的312μmol/L分别降至252μmol/L、225μmol/L以及176μmol/L。（4）以鱼藤酮处理U87细胞建细胞DNA损伤模型。毛细管电泳法检测细胞中8-OH-dG含量,未处理时为139μmol/L,鱼藤酮处理后增至270μmol/L,结果显示鱼藤酮对U87细胞造成明显损伤。但经不同抗氧化剂处理细胞后检测,结果显示,姜黄素和槲皮素对鱼藤酮造成的损伤具有极好的保护效果,8-OH-dG含量分别降至174μmol/L和186μmol/L,数据说明姜黄素的保护效果略高于槲皮素的效果。

关键词： DNA氧化损伤 8-OH-dG 毛细管电泳抗氧化剂

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黄连素抗氧化活性及其对癌细胞毒性的研究

黄连素抗氧化活性及其对癌细胞毒性的研究

作者：杨玉玲西北师范大学

学位级别：硕士

黄连素是从黄连、黄柏、三棵针等数十种中药中提取的一种季胺类化合物，属于异喹啉生物碱，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗心力衰竭、保护缺血心肌、抑制血管平滑肌增殖、降血压、降血脂、降血糖、抗血小板聚集等药理活性。近... 详细信息

黄连素是从黄连、黄柏、三棵针等数十种中药中提取的一种季胺类化合物，属于异喹啉生物碱，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗心力衰竭、保护缺血心肌、抑制血管平滑肌增殖、降血压、降血脂、降血糖、抗血小板聚集等药理活性。近年来，对其抗氧化活性及抗癌活性的研究备受人们关注。本文以黄连素为材料，测定了它在体外的抗氧化及抗癌活性。采用MDA测定、琼脂糖凝胶电泳、彗星电泳技术和SDS-PAGE法，检测了对脂质过氧化、DNA氧化断裂和蛋白质氧化损伤的保护作用;用黄嘌呤氧化酶-NBT还原法、甲基紫法、DMPD·+法及Oyaiuz法测定清除超氧阴离子、羟自由基及DMPD·+自由基的能力和还原力的大小。还检测了黄连素对肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株K562的毒性、对细胞增殖的抑制作用、对K562细胞DNA的损伤作用和诱导K562细胞凋亡作用。结果如下：(1)黄连素对生物大分子的氧化损伤有较好的保护作用。在抑制脂质过氧化时，浓度为5μmol·L时，抑制率为1.6 %;320μmol·L时，抑制率达到95.5 %。在保护DNA的氧化断裂时，在10 mmol·L AAPH引发的质粒pBR322DNA氧化的体系中，低浓度下(5μmol·L)其对DNA氧化断裂有微弱的保护作用;80μmol·L时基本完全保护DNA的氧化断裂。在50μmol·L H2O2诱导的人外周血单个核细胞DNA氧化损伤的模型中，6.25μmol·L黄连素使细胞DNA损伤显著减少，损伤率从81.7 %降至66.2 %;当浓度达到100μmol·L时，损伤率降为48.4 %。黄连素对蛋白质氧化损伤的保护作用与Trolox接近，320μmol·L时，均可完全保护蛋白质不被氧化降解。(2)黄连素在体外有较强的清除自由基的能力和还原力。它对超氧阴离子的清除效果优于Trolox，浓度为160μmol·L时，其清除率已达到99.2 %。对羟自由基也具有很好的清除作用，与Trolox的清除效果基本相当，当浓度为160μmol·L时，清除率分别达到91.0 %和96.0 %。在FeCl3引发的氧化体系中，黄连素清除DMPD·+的作用较弱，浓度达到1 280μmol·L时，清除率只达到35.0 %。此外，Oyaiuz法表明黄连素还具有较好的还原力。(3)在对肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株K562的抑制作用中，黄连素可明显抑制两种癌细胞的增殖，且具有浓度和时间依赖性;黄连素处理24、48 h后，对HepG2细胞的IC50分别为19μmol·L和9μmol·L;对K562细胞的IC50分别为11μmol·L和3μmol·L，表明对两种细胞都具较高毒性，而且K562细胞对黄连素更敏感;在较高浓度(80、160μmol·L)处理48 h可引起两种癌细胞死亡。(4)在用彗星电泳技术检测黄连素对K562细胞DNA的损伤作用中，处理细胞48 h后，2.5μmol·L时，损伤率为23.4 %(基础损伤率为10.0 %);当浓度为160μmol·L时，损伤率已达到92.8 %。说明高浓度黄连素可引起严重的K562细胞DNA的损伤。(5)在AO/EB双染法检测黄连素诱导K562细胞凋亡的实验中，作用呈浓度和时间依赖关系。处理细胞24 h后，40μmol·L和160μmol·L黄连素处理组细胞凋亡率分别为16.9 %和29 %(对照细胞凋亡率为10.1 %);处理48 h后，160μmol·L时凋亡率达到75.2 %(对照细胞凋亡率为5.2 %)。综上，黄连素在体外多个体系中有较好的抗氧化活性;对肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株K562有很强的生长抑制作用;此外，黄连素在较高浓度可诱导K562细胞凋亡，其诱导凋亡的作用可能和引起细胞DNA损伤有关。

关键词：黄连素活性氧抗氧化细胞毒性细胞凋亡

对映—贝壳杉烷型二萜Wangzaozin A抗血管形成活性的研究

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对映—贝壳杉烷型二萜Wangzaozin A抗血管形成活性的研究

作者：薛莹西北师范大学

学位级别：硕士

近年来,恶性肿瘤的发病率呈现上升趋势。随着社会经济发展和人民生活水平提高,饮食结构改变以及人口老龄化、城市化,我国的疾病谱和死亡谱发生显著变化,慢性非传染性疾病已经成为导致死亡的主要原因。其中,恶性肿瘤是目前全世界的主要... 详细信息

近年来,恶性肿瘤的发病率呈现上升趋势。随着社会经济发展和人民生活水平提高,饮食结构改变以及人口老龄化、城市化,我国的疾病谱和死亡谱发生显著变化,慢性非传染性疾病已经成为导致死亡的主要原因。其中,恶性肿瘤是目前全世界的主要死亡原因之一,已经成为严重危害人类生命健康、制约社会经济发展的一大类疾病。目前对于恶性肿瘤的治疗主要是通过手术、放疗、化疗进行,但恶性肿瘤会发生转移的特性是导致治疗失败和患者死亡的主要原因。目前没有理想的治疗手段可以彻底清除体内的癌细胞,所以,抑制肿瘤的恶化转移对于肿瘤的治疗是极为重要的。随着对肿瘤病理机制的深入了解,抗血管治疗已成为当前肿瘤治疗研究的热点。肿瘤的发生、发展和侵袭与血管生成密切相关,特别是转移病灶更依赖血管新生的作用。因此,寻找低毒、高效、特异性强的血管抑制剂对于控制恶性肿瘤有重要意义。香茶菜属植物在我国种类繁多,分布广泛,在民间作为药用历史悠久,具有清热解毒、活血化淤、抗菌消炎、抗肿瘤、治疗各种肝炎等多种活性。研究表明,对映-贝壳杉烷型二萜类化合物是香茶菜属植物中最具典型特征的化学成分,该类化合物含量丰富,是香茶菜属植物中主要的活性成分。Wangzaozin A就是其中之一,研究显示Wangzaozin A具有良好的抗肿瘤活性,但关于其抗血管新生的研究未见报道。本论文以人脐静脉内皮细胞HUVECs(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)为受试细胞,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)作为模拟肿瘤内环境中的刺激因子建立体外模型,MTT法和台盼蓝排染法检测了Wangzaozin A对HUVECs细胞生长抑制作用,流式细胞术检测对细胞周期分布的影响;划痕法、transwell法检测化合物对细胞迁移、浸润的影响,并在荧光染色后观察化合物伪足的形成的作用;利用matrigel(人工基质胶)进行三维培养观察化合物对网状结构形成的影响;并用western blotting法检测了Notch信号通路蛋白Notch1、RBP-Jκ、Hes1的表达水平。同时,以鸡胚绒毛尿囊膜模型进行体内实验,观察Wangzaozin A对血管新生的整体作用。主要结果如下:1.MTT法及台盼蓝排染法结果显示:Wangzaozin A对HUVECs具有生长抑制作用,随着处理浓度增大,抑制作用增强,IC0为4.21μM(MTT法)、2.09μM(台盼蓝排染法),且在相同剂量下这种抑制作用比对肺癌细胞A549(IC0为6.21μM)强。2.流式细胞术检测细胞周期结果显示:不同浓度的Wangzaozin A可在不同程度上将HUVECs的细胞周期阻滞在S期,且未检测到凋亡峰。划痕实验表明,Wangzaozin A可抑制VEGF诱导的HUVECs细胞的迁移活动,且此作用存在剂量效应。3.浸袭实验结果显示:VEGF可诱导HUVECs细胞活化,并通过水解基底膜发生浸润,Wangzaozin A会阻遏这一过程,并且随浓度增大,转移的细胞数目减小。4.血管网状结构形成实验结果显示:HUVECs细胞在matrigel内可形成连续的网管状结构,经Wangzaozin A处理后的细胞在matrigel中成管能力下降,且浓度越高,管状结构越不完整。5.微丝染色观察伪足发现:VEGF可诱导HUVECs伸出大量伪足,且在相邻细胞间形成连接,不同浓度Wangzaozin A不同程度地阻断伪足的形成,继而影响HUVECs的迁移及浸润过程,这一作用呈浓度依赖性。6.Western blotting实验结果显示:高浓度Wangzaozin A对Notch信号通路有正调控作用,可以上调Notch1、RBP-Jκ及Hes1的表达。7.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型中,经Wangzaozin A处理后鸡胚绒毛尿囊膜血管发育受抑制甚至不发育,不能形成健康连续的血管,说明中、高剂量组Wangzaozin A有抑制CAM血管形成的作用。Wangzaozin A可以破坏鸡胚绒毛尿囊膜血管网络的形成;细胞学和蛋白表达研究表明,它可抑制HUVECs细胞的增殖,并能通过上调Notch信号通路,抑制内皮细胞迁移、浸袭和网状结构的形成这可能是其发挥抑制血管生成的机制。这一结果为Wangzaozin A在以血管生成为靶点的治疗提供理论依据。

关键词：对映-贝壳杉烷型二萜 Wangzaozin A 血管新生抑制 HUVECs CAM

Trolox增强三氧化二砷对HL-60细胞毒性作用的研究

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Trolox增强三氧化二砷对HL-60细胞毒性作用的研究

作者：张亚楠西北师范大学

学位级别：硕士

癌症是严重危害人类健康的主要疾病。其发生是一个非常复杂的过程,该过程是无控制的细胞增殖伴随着细胞凋亡的抑制。大部分的化疗药物都是通过抑制癌细胞生长和诱导凋亡的方式发挥他们的细胞毒性作用,所以用药物诱导肿瘤细胞凋亡是有效... 详细信息

癌症是严重危害人类健康的主要疾病。其发生是一个非常复杂的过程,该过程是无控制的细胞增殖伴随着细胞凋亡的抑制。大部分的化疗药物都是通过抑制癌细胞生长和诱导凋亡的方式发挥他们的细胞毒性作用,所以用药物诱导肿瘤细胞凋亡是有效的治疗途径。三氧化二砷(AsO)作为临床治疗急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia ,APL)药物,具有很好的疗效。AsO只能在较高的浓度下诱导非APL细胞发生凋亡,因此其毒性限制了临床应用。有资料表明,在体外实验中一些抗氧化剂能够促进低浓度AsO诱导细胞的凋亡作用。 Trolox,也称水溶性维生素E(6- Hydroxy - 2,5,7,8- tetramethylchroman -2- carboxylic acid),为维生素E衍生物。由于其较好的细胞通透性而可发挥较强的抗氧化活性,近年来在科学研究中应用广泛。如用Trolox协同AsO作用,可能在诱导细胞凋亡的同时减小AsO细胞毒作用,使AsO更广泛的应用于临床。本文利用MTT,台盼蓝排染,Hoechst33258荧光染色、瑞氏-姬姆萨染色、单细胞凝胶电泳、流式细胞术以及DCHF-DA法检测了AsO单独及联合Trolox后对人早幼粒白血病细胞HL-60的增殖抑制、凋亡诱导作用、DNA损伤作用、周期阻滞和活性氧含量的影响,并通过单细胞凝胶电泳法检测Trolox联合AsO对人外周血单个核细胞DNA损伤的影响。结果表明: (1)低浓度AsO(≤4μmol·L)对HL-60细胞具有生长抑制效应,联合100μmol·L Trolox后,可以显著增强AsO对细胞的生长抑制作用,较高浓度的AsO(≥8μmol·L)联合Trolox作用能够诱导HL-60细胞死亡。生长抑制效应和致死效应都表现出显著的时间和AsO的剂量依赖性。 (2)AsO作用于HL-60细胞可以导致细胞DNA损伤,损伤率具有明显的剂量效应;联合100μmol·L Trolox后,HL-60细胞DNA损伤明显增强。DNA损伤可能是单独及联合作用引起细胞生长抑制及死亡的主要因素之一。 (3)AsO联合100μmol·L Trolox可显著影响细胞的周期分布,使细胞发生G2/M期周期阻滞;G2/M期阻滞可能是细胞DNA损伤激活检验点的结果。姬姆萨和荧光染色的结果中细胞出现的多核状态,说明也可能是药物影响细胞骨架及分裂装置构建造成了G2/M期阻滞。周期阻滞可能是AsO联合100μmol·L Trolox诱导细胞凋亡的上游事件。 (4)AsO作用于HL-60细胞可导致细胞内活性氧含量的增加,并表现出明显的剂量效应;联合100μmol·LTrolox后,低浓度AsO使得活性氧含量进一步升高。 (5)流式细胞术的结果显示联合组加入过氧化氢酶对细胞的凋亡率并没有影响,说明Trolox的增强AsO诱导凋亡作用与细胞外H2O2的生成无关。 (6)在正常人外周血单个核细胞中,100μmol·L Trolox的加入可以显著降低AsO诱导的DNA损伤作用。说明联合Trolox后,降低了AsO对正常细胞的毒性,这在AsO的进一步临床应用上具有重要意义。

关键词： As2O3 Trolox联合作用人早幼粒白血病细胞HL-60 细胞凋亡周期阻滞 DNA损伤

Leukamenin E对原代培养大鼠脑星形神经胶质细胞毒性作用的研究

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Leukamenin E对原代培养大鼠脑星形神经胶质细胞毒性作用的研究

作者：张丽西北师范大学

学位级别：硕士

毒理学是研究化学物质对生物体的毒性反应及其严重程度、发生频率和毒性作用机制,也是对毒性作用进行定性和定量评价的一门学科。体外细胞实验等生物技术由于其高通量、高精度、快速以及平行性的特点,已成为生物医学研究领域中的一项先... 详细信息

毒理学是研究化学物质对生物体的毒性反应及其严重程度、发生频率和毒性作用机制,也是对毒性作用进行定性和定量评价的一门学科。体外细胞实验等生物技术由于其高通量、高精度、快速以及平行性的特点,已成为生物医学研究领域中的一项先进实用的技术,具有很高的应用价值。毒理学的研究必定要深入到细胞及分子水平。中药(尤其是其复方制剂)成分复杂,应用传统方法评价中药的遗传毒性十分困难,而借助现代细胞学技术,从细胞水平上对药物在体外进行准确、快速、高效的安全性评价,使得我们能从微观角度更好地了解中药遗传毒性的作用靶点及其作用机制。星形神经胶质细胞(astrocyte,AS),作为神经系统中起营养、支持及保护神经元作用的一类细胞,由于其敏感性高,更易受到毒性物质的损伤。许多证据表明,星形神经胶质细胞在许多神经退行性疾病中有十分重要的作用。迄今为止,有关星形神经胶质细胞毒性的研究尚未见到报道。香茶菜属植物几乎遍布我国各地,并且种类繁多,约有30种原植物在民间作药用,具有清热解毒、活血化淤、抗菌消炎、抗肿瘤、治疗肝炎等各种功效。在药用香茶菜中,二萜类化合物含量丰富,是其主要的活性成分。其中C-20-未氧化-对映-贝壳杉烯型二萜化合物是生物活性最强的一类,Leukamenin E即为其中的一种。本论文进行了Wistar大鼠星形神经胶质细胞的纯化培养,以对映-贝壳杉烯二萜化合物Leukamenin E为受试药物,通过SRB检测、台盼蓝排染、彗星电泳、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染、细胞形态的观察及核染色质形态观察等方法,初步研究了该化合物对星形神经胶质细胞生长的影响以及其作用机制,以期为Leukamenin E的进一步合理应用提供科学依据。结果如下: (1)成功培养了AS并对其进行了纯化。实验通过组织消化、限制性培养以及摇床震荡等方法,得到了纯度高、状态良好的AS培养物。原代培养的AS在接种后2-3d完成贴壁,9-12d即可铺满培养瓶底。初级培养物含有包括小胶质细胞、成纤维细胞、少量神经元在内的多种细胞,通过限制性培养降低这些细胞的含量,而神经元逐渐退化,最终死亡;摇床震荡利用细胞差速贴壁的原理,除去杂细胞,最终得到纯度较高的AS培养物。 (2)SRB法及台盼蓝排染法检测细胞毒性结果显示,Leukamenin E对AS有很强的细胞毒性,在0.625μM以及1.25μM的低浓度作用下对细胞具有显著的生长抑制效应,而在5μM以及10μM的高浓度作用时能致细胞死亡。生长抑制效应和致死效应都具有显著的时间、剂量依赖性。 (3)倒置显微镜形态观察及吉姆萨染色显示,Leukamenin E作用可以引起细胞形态的显著改变,并且有明显的时间、剂量效应。吉姆萨染色实验中,随化合物浓度的增加(1.25μM、2.5μM),细胞膜表面微绒毛不清晰甚至消失,细胞核染色质凝集,在高浓度药物(5μM)作用下,观察到核碎裂。 (4)彗星电泳实验结果显示,化合物Leukamenin E可以引起AS DNA的损伤,并具有时间-剂量效应。随着化合物作用浓度的增加以及作用时间的延长,损伤细胞——彗星样细胞增多、损伤率显著增加,Olive尾矩(OTM)、尾长(TL)、尾部DNA的量(TDNA)也明显增加,并且细胞的损伤等级也随之升高。 (5) Hoechst 33258荧光染色以及AO/EB双染实验结果显示,Leukamenin E作用使细胞表现出明显的凋亡性特征,这说明Leukamenin E主要通过凋亡的方式引起星形神经胶质细胞的死亡,并且具有显著的时间-剂量效应。

关键词： Leukamenin E 星形神经胶质细胞细胞毒性生长抑制 DNA损伤细胞凋亡

黄连素诱导HepG-2细胞凋亡时活性氧与谷胱甘肽的变化及机制探讨

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黄连素诱导HepG-2细胞凋亡时活性氧与谷胱甘肽的变化及机制探讨

作者：孙志鹏西北师范大学

学位级别：硕士

细胞内、外源性活性氧不仅可以广泛地参与调节细胞信号传导途径，而且还可以通过修饰蛋白质或改变细胞内氧化还原状态，参与调控细胞凋亡信号转导。本文检测了黄连素单独处理及经NAC保护后HepG-2细胞增殖、细胞周期与细胞凋亡、细胞内... 详细信息

细胞内、外源性活性氧不仅可以广泛地参与调节细胞信号传导途径，而且还可以通过修饰蛋白质或改变细胞内氧化还原状态，参与调控细胞凋亡信号转导。本文检测了黄连素单独处理及经NAC保护后HepG-2细胞增殖、细胞周期与细胞凋亡、细胞内活性氧与谷胱甘肽的变化，探讨了黄连素诱导HepG-2细胞凋亡的机制。利用SRB法检测细胞增殖率;倒置显微镜观察细胞形态;荧光染料Hoechst33258观察细胞核形态;流式细胞术(PI单染法，Annexin-V-PI双染法)检测细胞周期和细胞凋亡;DCFH-DA染色后流式细胞术检测细胞内活性氧并观察细胞内活性氧分布;比色法检测细胞内谷胱甘肽。结果如下： (1) SRB法检测细胞毒性结果显示，黄连素对人肝癌细胞HepG-2有较强的毒性，作用存在时间-剂量依赖效应。浓度10μmol·L到80μmol·L时，表现为增殖抑制作用，随药物时间的延长其增殖抑制作用增强;其半抑制浓度IC50值24h时为44.10mol·L，48h为8.53μmol·L。当药物浓度增加到160μmol·L以上时，细胞开始死亡，表现为致死效应。 (2)使用倒置显微镜和Hoechst33258染色后荧光显微镜对细胞形态和核染色结果显示，黄连素引起HepG-2细胞胞体收缩，细胞变圆、失去贴壁能力，细胞核出现染色质凝集、边缘化与核碎裂，表现出细胞凋亡的形态特征。但抗氧化剂NAC保护后，凋亡特征有一定的缓解。 (3) AO/EB荧光双染观察结果显示，黄连素诱导HepG-2细胞发生凋亡。抗氧化剂NAC保护后，凋亡细胞数量有所降低。细胞增殖率实验显示，与NAC联合作用后，黄连素作用于HepG-2的增殖率回升，NAC保护效果明显。 (4) PI染色经流式细胞仪分析细胞周期结果显示，45和160μmol·L黄连素处理HepG-2细胞24h后出现“亚G1峰”(Sub-G1期)，Sub-G1期细胞的比率与药物浓度和处理时间呈正相关,并出现HepG-2细胞S期周期阻滞。黄连素与NAC联合作用降低了HepG-2Sub-G1期细胞百分比，从45μmol·L黄连素处理的15.53%减少到10.93%，160μmol·L黄连素处理的20.13%减少到14.73%。Annexin-V-PI复染流式分析法结果显示，45μmol·L黄连素引起HepG-2细胞凋亡，160μmol·L处理的细胞主要表现为由早期凋亡逐步向晚期凋亡发展的进程。经NAC保护后， HepG-2细胞凋亡率有所降低。 (5) DCFH-DA染色流式细胞术检测以及荧光显微镜观察胞内ROS表明，45和160μmol·L黄连素处理HepG-2细胞6h、12h、24h，胞内ROS含量持续升高，与黄连素的作用存在时间-剂量效应。NAC的加入可以降低黄连素产生的ROS量。比色法检测GSH表明，作用6h、12h、24h时，45和160μmol·L使胞内GSH含量持续降低，与黄连素的作用存在时间和剂量依赖负效应。并且NAC可以使黄连素降低的GSH含量得到提高。本研究中多个指标证实，黄连素通过影响HepG-2胞内氧化还原系统，即促进ROS的产生，降低GSH的含量，进而诱导HepG-2细胞凋亡。

关键词：黄连素 NAC 肝癌细胞细胞凋亡活性氧谷胱甘肽

当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2致人脐静脉内皮细胞损伤的影响

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当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2致人脐静脉内皮细胞损伤的影响

作者：顾丽娟甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院)

学位级别：硕士

目的:观察当归红芪合剂超滤膜提取物对过氧化氢(H2O2)损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用和内皮细胞凋亡相关基因在此过程中的作用,探讨其在心脑血管疾病治疗中的机制。方法:用200μmol·L-1 H2O2制造HUVEC损伤模型;按分组把不同浓... 详细信息

目的:观察当归红芪合剂超滤膜提取物对过氧化氢(H2O2)损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用和内皮细胞凋亡相关基因在此过程中的作用,探讨其在心脑血管疾病治疗中的机制。方法:用200μmol·L-1 H2O2制造HUVEC损伤模型;按分组把不同浓度、不同分子量(5万分子量,10万分子量,20万分子量)的当归红芪合剂超滤膜提取物于损伤后加入,分别测定细胞活力(MTT法),观察当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2损伤内皮细胞活性的影响;实验分正常对照组、单纯药物组、H2O2损伤组、药物干预组,采用黄嘌呤氧化酶法检测细胞中SOD活力;采用硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(MDA)活力;流式细胞仪技术检测细胞周期及细胞凋亡;化学法检测细胞内Ca2+浓度及细胞培养上清液中NO的浓度;应用RT-PCR和微阵列相结合的实验新技术―PCR Array‖检测与内皮细胞损伤相关的分子在各组间的差异表达;RT-PCR技术从m RNA水平检测各组与凋亡相关的基因的表达;Western Blot技术从蛋白水平检测各组凋亡相关基因的表达。结果:1.MTT结果显示:100、200、300μmol·L-1的H2O2分别作用ECV-304细胞6h、12h、24h、48h后细胞活性明显下降,与正常对照组比较有显著性差异(P﹤0.05)。200μmol·L-1的H2O2孵育6h,细胞活性值为正常对照组细胞活性值的一半(LD50),细胞损伤适中。2.不同浓度当归红芪合剂超滤膜提取物用药组与对照组之间MTT值有显著性差异(P<0.05);当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV-304细胞32h,在1.5g/L1.0g/L浓度范围内有显著的促增殖作用。尤其以6.0g/L5.0g/L浓度范围增殖作用达高峰。3.H2O2+当归红芪合剂超滤膜提取物5万、10万、20万分子量6.0g/L,与对照组比较有显著性差异(P﹤0.05);与H2O2损伤组相比有显著性差异(P﹤0.05),且以10万分子量6.0g/L的增殖作用最强;4.200μmol·L-1 H2O2作用ECV304细胞6h后可以明显降低SOD的活力,提高MDA的含量,与正常对照组相比具有显著性差异(P﹤0.05);药物干预组与H2O2组相比有显著性差异(P﹤0.05)。与正常对照组比较,H2O2损伤组细胞内Ca2+浓度明显上升(P﹤0.05);与H2O2损伤组比较,药物干预组细胞内Ca2+浓度明显下降(P﹤0.05)。5.与正常对照组比较,H2O2损伤组细胞凋亡率明显增加(P﹤0.05),细胞HSP70基因表达上调(P﹤0.05),e NOSm RNA表达下调(P﹤0.05),细胞培养上清液中NO含量降低(P﹤0.05)。与H2O2损伤组比较,药物干预组细胞凋亡率明显降低(P﹤0.05),细胞HSP70基因表达上调(P﹤0.05),e NOSm RNA表达上调(P﹤0.05),细胞培养上清液中NO含量升高(P﹤0.05)。结论:1.过氧化氢可以引起内皮细胞存活率下降,其中以200μmol·L-1作用6h细胞损伤适中。2.当归红芪合剂超滤膜提取物作用ECV304细胞32h,在1.5g/L1.0g/L浓度范围内有显著的促增殖作用。尤其以6.0g/L5.0g/L浓度范围增殖作用达高峰。3.当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2损伤后的内皮细胞有保护作用,其中以10万分子量,6.0g/L保护效果最为明显。且其保护作用可能是通过调节细胞周期参与了对ECV304增殖的影响。4.当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2致内皮损伤的细胞具有保护作用,其作用是通过提高SOD的活力,降低MDA的活力,减少细胞内Ca2+的释放,以及减少内皮细胞凋亡等机制来实现的。5.当归红芪合剂超滤膜提取物对H2O2引起的内皮细胞损伤有拮抗作用,具有抗H2O2致人脐静脉内皮细胞凋亡的作用,具有促进HSP70基因的表达,维持正常内皮细胞功能,上调e NOSm RNA表达,维持NO合成与分泌的作用。

关键词：超滤膜当归过氧化氢红芪人脐静脉内皮细胞

姜黄素促氧化诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的实验研究

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姜黄素促氧化诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的实验研究

作者：李贵琛西北师范大学

学位级别：硕士

姜黄素(Curcumin,Cur)是一种从姜科植物姜黄的块茎中分离提取得到的多酚类化合物。现代药理学研究认为姜黄素可能具有抗氧化,抗炎和抗肿瘤等多种药理学功能。近期研究发现,姜黄素可能通过促氧化行使其抗癌作用。人脑胶质瘤属于颅内常见... 详细信息

姜黄素(Curcumin,Cur)是一种从姜科植物姜黄的块茎中分离提取得到的多酚类化合物。现代药理学研究认为姜黄素可能具有抗氧化,抗炎和抗肿瘤等多种药理学功能。近期研究发现,姜黄素可能通过促氧化行使其抗癌作用。人脑胶质瘤属于颅内常见的原发性肿瘤,术后难根治,易复发,死亡率高,常见的术后防治常以放射治疗为主。本实验在生物化学体系中检测了姜黄素对羟自由基,超氧阴离子产生和蛋白质氧化损伤的作用,并检测了姜黄素作用于人脑胶质瘤U87细胞后细胞增殖,细胞形态,活性氧变化,NADPH氧化酶活性和细胞凋亡,探讨了姜黄素诱导人脑胶质瘤U87细胞株凋亡是否与姜黄素的抗氧化及其潜在的促氧化性有关。以期为进一步了解姜黄素的药用机理及进一步应用提供科学依据。结果如下:1.甲基紫法作用表明,1μmol/L姜黄素对羟自由基的清除能力逐渐上升。70μmol/L时显著下降,说明高浓度姜黄素清除能力降低,可能具有促氧化作用。在蛋白氧化损伤测定中,姜黄素降低自由基AAPH对牛血清白蛋白(BSA)的氧化损伤;姜黄素对超氧阴离子的生成有一定的抑制作用,但在Cu2+存在下,姜黄素的抗氧化活性下降,对自由基损伤的BSA保护作用降低。2.MTT法检测细胞增殖率结果表明,姜黄素、H2O2对U87细胞的增殖都有抑制作用。10μmol/L和20μmol/L姜黄素联合100μmol/L H2O2使得增殖抑制加强,说明姜黄素可能通过加强H2O2作用-促氧化抑制细胞生长。3.倒置显微镜形态学观察显示,10μmol/L和20μmol/L姜黄素、100μmol/L H2O2作用后可以引起细胞形态的改变,特别是姜黄素与H2O2联合处理后,胞体收缩变圆等现象明显增加。4.Hoechst 33258荧光染色,AO/EB荧光染色和线粒体膜电位实验结果显示10μmol/L和20μmol/L姜黄素、100μmol/L H2O2可使细胞核或细胞质中出现染色质凝聚、核质边缘化等凋亡特征,细胞凋亡现象明显。姜黄素和H2O2单独或联合处理24 h后细胞的线粒体膜电位出现下降,说明细胞线粒体受损。同时,细胞周期结果显示,经姜黄素和H2O2作用后,细胞出现了S期阻滞的现象。5.DCFH-DA单染和NADPH氧化酶酶活性实验结果显示:10μmol/L和20μmol/L姜黄素单独或联合100μmol/L H2O2作用2 h后引起细胞内活性氧上升,6 h后细胞内活性氧水平下降;姜黄素单独处理或与H2O2联合作用3 h后细胞的NADPH氧化酶酶活上升,6 h后NADPH氧化酶酶活下降,NADPH氧化酶抑制剂APO可对细胞NADPH氧化酶的酶活性干预,3 h与6 h后细胞的酶活性均下降。DHE荧光探针检测U87细胞内超氧化物的变化,进一步说明10μmol/L,20μmol/L姜黄素单独处理或与100μmol/L H2O2联合作用3 h和6 h后可引起细胞内超氧化物含量的上升。本研究各项指标显示,姜黄素可能在一定的生物化学体系内表现出抗氧化活性下降,对蛋白质的保护作用下降,甚至促氧化的现象;同时,姜黄素单独或与H2O2联合作用,可使细胞的线粒体受损,细胞内活性氧水平上升,NADPH氧化酶活性增高,细胞内超氧化物含量上升,发生S期阻滞效应,出现细胞凋亡现象。综合以上说明,姜黄素可能通过诱导人脑胶质瘤细胞内活性氧升高(如超氧化物)引起细胞凋亡。

关键词：姜黄素抗氧化促氧化人脑胶质瘤细胞细胞凋亡

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姜黄素通过ROS诱导人脑胶质瘤细胞凋亡

姜黄素通过ROS诱导人脑胶质瘤细胞凋亡

作者：冉苗苗西北师范大学

学位级别：硕士

姜黄素(Curcumin,Cur)是从姜黄根茎中分离得到的一种天然膳食多酚类化合物,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和促进伤口愈合等多种药理活性。研究表明,姜黄素作为抗氧化剂可以抑制多种类型癌细胞生长,包括肺癌、乳腺癌... 详细信息

姜黄素(Curcumin,Cur)是从姜黄根茎中分离得到的一种天然膳食多酚类化合物,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和促进伤口愈合等多种药理活性。研究表明,姜黄素作为抗氧化剂可以抑制多种类型癌细胞生长,包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胰腺癌和结肠癌,但对人脑胶质瘤研究甚少。少量动物模型的实验和临床研究也证明了姜黄素的抗癌作用。近期有研究发现,姜黄素发挥抗肿瘤活性可能是由于促进细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平升高,通过氧化胁迫来实现的。本文以人脑胶质瘤细胞U87为细胞模型,检测并评价姜黄素对细胞增殖、细胞活性氧水平、氧化应激指标和细胞凋亡等方面的作用,深入探讨该化合物的抗癌作用是否与其促氧化性有关,为姜黄素的临床应用及功能食品开发提供数据和理论参考。论文结果如下:1.CCK-8法检测姜黄素对细胞增殖的影响显示,姜黄素对U87细胞的增殖有明显的抑制作用,在5-100μM的浓度范围内随着姜黄素浓度的升高,U87细胞增殖率降低,呈浓度依赖性,回归分析IC为68.32μM;台盼蓝排染法检测姜黄素对细胞致死率显示,姜黄素处理U87细胞24 h后,随着姜黄素浓度的升高对U87细胞致死率上升。结果表明姜黄素抑制U87细胞生长。2.光学显微镜下观察姜黄素处理后细胞形态学变化显示,姜黄素作用U87细胞后,可引起细胞出现胞体收缩变圆等现象,浓度越高这种变化越明显;当姜黄素与抗氧化剂5m M GSH联合处理后,细胞恢复到与对照组相似的形态,提示姜黄素引起的细胞形态变化可能和氧化作用有关。3.用DCFH-DA荧光探针和电化学法检测细胞ROS含量显示,姜黄素作用U87细胞后,胞内ROS水平上升,且加入抗氧化剂GSH后,ROS水平回落。酶联免疫标记检测细胞NADPH氧化酶活力发现,5-40μM姜黄素作用于U87细胞24 h后,与对照组相比处理组胞内NADPH氧化酶活力均升高;当NADPH氧化酶Nox1/Nox4抑制剂GKT137831联合处理后NADPH氧化酶活力降低,说明姜黄素引起胞内ROS升高可能来源于NADPH氧化酶途径。4.对氧化应激指标总抗氧化力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的检测结果表明,5-40μM姜黄素处理后,U87细胞内T-AOC显著降低,且随着姜黄素浓度升高T-AOC逐渐降低;胞内MDA水平明显升高,且呈剂量依赖性;胞内GSH水平明显降低,也呈剂量依赖性;这些结果都说明,姜黄素使得U87细胞处于氧化胁迫状态,且随着浓度的升高胁迫加重。胞内SOD水平也随姜黄素浓度升高,说明细胞氧化胁迫诱导该酶表达升高,也表明了姜黄素具有促氧化作用。5.Annexin V/PI双染后流式细胞术检测和AO/EB荧光染色检测细胞凋亡都表明:5-40μM姜黄素处理24 h后,U87细胞发生凋亡,细胞总凋亡率明显上升,呈现浓度依赖性,且10μM、40μM姜黄素分别加入抗氧化剂GSH联合处理后,会减弱姜黄素诱导的细胞凋亡,表明凋亡作用是由氧化作用导致。6.通过免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白信号通路发现,姜黄素处理使NF-κB/p65蛋白的表达水平明显下降,与5m M GSH共同处理后蛋白表达水平上升,即姜黄素引起的ROS升高可以下调NF-κB/p65蛋白的表达;检测线粒体内源性凋亡途径中相关蛋白发现:姜黄素可以升高促凋亡蛋白Bax的表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,即升高Bax/Bcl-2值;并发现姜黄素诱导的细胞凋亡可能是caspase依赖的。检测结果发现姜黄素可下调Pro Caspase-3的表达,说明相对增加了其激活形式的Caspase-3的量进而诱导了细胞凋亡。检测还发现姜黄素诱导的细胞死亡可能与焦亡相关蛋白Caspase-1有关。加入抗氧化剂GSH检测信号通路蛋白的实验结果说明,姜黄素诱导的细胞死亡是通过促氧化作用实现的。综上各项研究结果表明,姜黄素在作用于人脑胶质瘤U87细胞后,通过提高细胞NADPH氧化酶活性而促进ROS产生,引起细胞内氧化应激指标改变,T-AOC降低、MDA升高、GSH下降、SOD升高,即姜黄素处理使得U87细胞处于氧化胁迫,且随着浓度增加胁迫加重;ROS的生成,触发细胞信号通路,下调NF-κB/p65蛋白的表达,诱导线粒体内源性凋亡途径中Bax和Bcl-2的差异性表达,通过凋亡执行分子Caspase-3使细胞凋亡。

关键词：姜黄素人脑胶质瘤细胞促氧化活性氧氧化应激细胞凋亡