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沙眼衣原体CT622效应蛋白通过激活Erk/p38 MAPK信号通路抑制HeLa细胞凋亡

沙眼衣原体CT622效应蛋白通过激活Erk/p38 MAPK信号通路抑制HeLa...

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作者：彭彬峰南华大学

学位级别：硕士

目的:沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种具有独特二相发育周期的原核细胞微生物,是全世界范围内导致性传播疾病最常见的病原体之一,其感染也是临床上导致不孕不育的主要原因。沙眼衣原体整个生命周期都需寄生于真核细胞内,通... 详细信息

目的:沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种具有独特二相发育周期的原核细胞微生物,是全世界范围内导致性传播疾病最常见的病原体之一,其感染也是临床上导致不孕不育的主要原因。沙眼衣原体整个生命周期都需寄生于真核细胞内,通过分泌效应蛋白与宿主细胞相互作用进而操控宿主细胞关键的信号通路,并在感染过程中已进化出有效的策略来抑制宿主细胞的凋亡以完成自身的生长发育。Ⅲ型分泌系统(T3SS)是Ct发挥毒力的关键,并通过分泌效应蛋白介导了与宿主的相互作用,而CT622作为一种T3SS新型的效应蛋白,在Ct感染入侵和生长发育过程有着极为重要的作用,然而,CT622蛋白对宿主细胞增殖、凋亡的影响以及相关信号通路尚不清楚。本研究以HeLa细胞为细胞模型,探讨了沙眼衣原体效应蛋白CT622对宿主细胞凋亡的调控作用,并研究CT622参与调控宿主细胞凋亡途径的关键信号通路,进一步阐明CT622在Ct致病过程中的作用。方法:1.以Ct D型基因组为模板构建原核表达重组载体pGEX-6p-1/CT622;重组载体经 IPTG 诱导表达,Glutathione Sepharose 4B beads 纯化 GST-CT622 融合蛋白,PreScission Protease酶切除GST标签后获取纯化的CT622蛋白。2.将纯化的CT622蛋白去内毒素处理后,分别用PBS以及浓度为 0、5、10、15、20 和 25 μg/mL 的 CT622 刺激 HeLa 细胞 24 h,CCK-8检测细胞存活率(%)。3.用不同浓度梯度的CT622处理HeLa细胞20h,加入肿瘤坏死因子TNF-α凋亡诱导剂继续处理4 h,Western blot检测cleaved caspase-3,Bax和Bcl-2表达水平。用流式细胞术及Hoechst 33258荧光染色检测各组细胞的凋亡情况。4.以最佳浓度的CT622分别处理HeLa细胞0、15、30、60和120 min,Western blot检测p38 MAPK和Erk1/2信号通路的磷酸化情况。5.分别用30μM的PD98059(Erk1/2通路)抑制剂和SB203580(p38 MAPK通路)抑制剂处理HeLa细胞0.5 h,加入CT622刺激20 h,接着加入TNF-α继续处理4 h,检测细胞Caspase-3、Bax以及Bcl-2的表达水平。随后流式细胞术以及Hoechst 33258荧光染色检测加入PD98059或SB203580抑制剂前后各组细胞的凋亡情况。结果:1.经诱导表达及纯化等处理,成功获得CT622蛋白。***-8结果表明,本研究中制备的CT622蛋白在一定浓度范围内对HeLa无明显毒性作用并对细胞增值起促进作用。*** blot结果表示,HeLa细胞经过CT622刺激,其Bcl-2表达水平上调,Cleaved caspase-3和Bax表达水平下调;Hoechst 33258染色结果发现,与对照组相比,HeLa细胞经过CT622刺激后较形态正常,凋亡小体数量少。流式细胞术的结果也发现,经TNF-α处理蛋白组细胞的凋亡率明显低于单纯TNF-α凋亡诱导组(P<0.05)。*** blot 检测到经 CT622 刺激后,Erk1/2 和 p38 MAPK 磷酸化水平明显上调。分别抑制Erk1/2和p38 MAPK通路后,使用CT622刺激细胞,流式细胞术及Hoechst 33258染色结果均显示,无论是否经TNF-α处理,CT622刺激细胞后凋亡小体数量增加,且凋亡现象均有所升高。抑制Erk1/2或p38 MAPK通路后,无论是否经TNF-α处理,CT622处理组细胞的Cleaved caspase-3的表达水平和Bax/Bcl-2比值均明显上调。结论:CT622通过激活Erk1/2和p38 MAPK信号通路上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调Bax、Cleaved caspase-3等促凋亡蛋白表达抑制HeLa细胞凋亡。

关键词：沙眼衣原体 CT622效应蛋白 MAPKs信号通路细胞凋亡

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成纤维细胞生长因子18（FGF18）腺病毒包装及其在小鼠骨关节炎治疗中的作用

成纤维细胞生长因子18（FGF18）腺病毒包装及其在小鼠骨关节炎治...

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作者：李嘉怡南华大学

学位级别：硕士

目的:探究成纤维生长因子18(Fibroblast growth factor18,FGF18)对软骨细胞分化的影响,以及其对内侧半月板不稳定模型(Destabilization of the medial meniscus,DMM)小鼠骨关节炎的治疗效果,为利用FGF18治疗骨关节炎提供实验依据。方法... 详细信息

目的:探究成纤维生长因子18(Fibroblast growth factor18,FGF18)对软骨细胞分化的影响,以及其对内侧半月板不稳定模型(Destabilization of the medial meniscus,DMM)小鼠骨关节炎的治疗效果,为利用FGF18治疗骨关节炎提供实验依据。方法:利用PCR的方法获取FGF18全长基因片段,再用AgeⅠ和NheⅠ酶切目的基因和pYr-1.1载体,连接后得到pYr-FGF18质粒。通过LR体外同源重组,将pYr-FGF18的表达框转移到pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上,得到pAd/PL-FGF18质粒。用PacⅠ酶切pAd/PLFGF18,将线性化的质粒转染至HEK293A细胞中包装得到Ad-FGF18重组腺病毒载体,并进行扩增、纯化。Ad-GFP腺病毒也用同样的方法得到。用Ad-FGF18腺病毒感染HEK293A细胞并鉴定感染后的细胞中FGF18基因是否过表达。用Ad-FGF18腺病毒感染软骨细胞,观察其对软骨细胞分化的影响。对小鼠施行DMM手术,术后第2周开始关节腔内注射Ad-FGF18腺病毒,持续6周,术后第8周处死。取小鼠腿部进行石蜡包埋,切片后进行SO染色,观察关节软骨的受损情况。通过免疫荧光法和免疫组化法染色观察小鼠关节腔内注射Ad-FGF18腺病毒后FGF18在关节软骨处的过表达情况。利用免疫组化法染色观察关节腔内注射Ad-FGF18腺病毒的小鼠关节软骨处骨关节炎分化标志物的表达情况。结果:经PCR扩增成功获得大小为624bp的FGF18目的基因片段。将FGF18目的基因与pYr-1.1载体连接得到pYr-FGF18腺病毒穿梭质粒,测序结果与FGF18在基因库中的序列一致。pYr-FGF18和pAd/PLDEST体外同源重组得到pAd/PL-FGF18,将线性化后的质粒转染至HEK293A细胞中包装腺病毒,几天后细胞出现CPE现象。收集病毒并使其感染HEK293A细胞后,HEK293A细胞在mRNA水平和蛋白质水平上均能过表达FGF18。Ad-FGF18感染软骨细胞后,软骨细胞中的FGF18表达量增高,同时软骨分化标志物II型胶原蛋白(Col2)、聚蛋白多糖(Aggrecan)和Sox9的表达量也增高。DMM小鼠关节腔内注射Ad-FGF18腺病毒后,关节软骨处FGF18表达增高,与注射Ad-GFP腺病毒的小鼠相比,高表达FGF18的小鼠关节软骨处的损伤比较轻微。免疫组化结果显示,注射Ad-FGF18的小鼠关节处Col2和Aggrecan的表达增加,Adamts的表达明显降低,基质金属蛋白酶3(Matrix metalloproteinase 3,MMP3)和基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 3,MMP13)的表达稍有降低。结论:1.成功构建重组Ad-FGF18腺病毒载体,并能在HEK293A细胞中表达。***-FGF18腺病毒能够促进软骨细胞的分化。***小鼠关节腔内注射Ad-FGF18腺病毒能够对关节炎起到一定的治疗作用。

关键词：成纤维生长因子18 重组腺病毒载体 DMM模型骨关节炎

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梅毒螺旋体重组蛋白Tp0768通过TLR2/ER应激途径增强HUVECs促中性粒细胞趋化作用

梅毒螺旋体重组蛋白Tp0768通过TLR2/ER应激途径增强HUVECs促中性...

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作者：曹婷南华大学

学位级别：硕士

目的:本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为靶细胞,探讨了梅毒螺旋体重组蛋白Tp0768增强HUVECs促进中性粒细胞趋化作用,并确定了TLR2和ER应激等信号分子在HUVECs趋化因子分泌中的作用,为研究Tp0768促进血管炎症的发生机制提供了新的思路... 详细信息

目的:本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为靶细胞,探讨了梅毒螺旋体重组蛋白Tp0768增强HUVECs促进中性粒细胞趋化作用,并确定了TLR2和ER应激等信号分子在HUVECs趋化因子分泌中的作用,为研究Tp0768促进血管炎症的发生机制提供了新的思路,同时也为梅毒螺旋体致病机制的研究奠定基础。方法:1.构建原核载体,表达并纯化梅毒螺旋体重组蛋白Tp0768。***0768刺激HUVECs后,RT-qPCR检测HUVECs的CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达水平;ELISA检测上清液中CXCL1、CXCL2和CXCL8的蛋白表达水平;取共培养后的上清液做中性粒细胞Transwell实验,检测中性粒细胞的趋化能力。***0768刺激HUVECs后,RT-PCR检测TLR1、TLR2、TLR4和MyD88的mRNA表达水平;WB检测TLR2、PERK、IRE1的蛋白表达水平;使用透射电子显微镜观察HUVECs内质网的形态和结构。4.使用TLR2抑制剂后,RT-qPCR检测CXCL1、CXCL2、CXCL8和MyD88的mRNA表达水平;ELISA检测CXCL1、CXCL2和CXCL8的蛋白表达水平;WB实验检测PERK、IRE1、BIP的蛋白表达水平;中性粒细胞Transwell实验检测中性粒细胞的趋化能力。5.使用MyD88抑制剂后,RT-PCR检测CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA水平;CCK8检测HUVECs的活性水平。6.分别使用PERK和IRE1的抑制剂后,RT-qPCR检测CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达水平;ELISA检测CXCL1、CXCL2和CXCL8的蛋白表达水平;中性粒细胞Transwell实验检测中性粒细胞趋化能力的改变。结果:1.构建原核表达载体并表达纯化后,得到浓度为1.1mg/m L、纯度大于90%的Tp0768蛋白。***0768刺激HUVECs诱导其CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA和蛋白表达水平以剂量依赖性的方式增加,并促进了中性粒细胞的趋化作用。***0768刺激HUVECs后,TLR2的mRNA表达水平增加,但TLR1和TLR4的mRNA表达水平与Tp0768的浓度并没有呈现相关性。使用TLR2的抑制剂后,CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA和蛋白表达水平明显降低,中性粒细胞的趋化也呈相同的趋势。***0768刺激HUVECs后,MyD88的mRNA表达水平有一定提高,但是与Tp0768的浓度的相关性并不是十分明显。使用TLR2抑制剂也并不能使MyD88的mRNA表达水平降低,同时使用MyD88的抑制剂预处理内皮细胞后,CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA并没有随着抑制剂的浓度的增高而降低,尽管在20μM时其表达降低,但CCK8结果显示,20μM时内皮细胞的活性显著降低。***0768可引起内皮细胞的内质网发生形态改变,内质网腔变大形成空泡,粗面内质网明显增多,ER应激相关信号通路PERK和IRE1的蛋白表达量增加,分别使用PERK和IRE1的抑制剂预处理内皮细胞后,CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,中性粒细胞的趋化也明显受到抑制。6.使用TLR2抑制剂预处理后,ER应激相关信号分子PERK、IRE1和BIP的蛋白表达水平明显受到抑制。结论:1.梅毒螺旋体重组蛋白Tp0768促进HUVECs分泌中性粒细胞趋化因子CXCL1、CXCL2和CXCL8,进而增强中性粒细胞的趋化作用。***0768上调HUVECs的促中性粒细胞趋化作用受到TLR2/ER应激的调控,且MyD88信号分子可能不参与该过程。

关键词：梅毒螺旋体 Tp0768 TLR2 ER应激趋化

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吉首地区土家族、苗族、汉族成人常用肝肾功能生化指标参考区间的建立

吉首地区土家族、苗族、汉族成人常用肝肾功能生化指标参考区间的...

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作者：陈真南华大学

学位级别：硕士

目的:通过检测吉首地区土家族、苗族、汉族健康成人的肝肾功能常用生化指标,分析指标在民族、性别、年龄层的差异,尝试初步建立符合吉首地区人群特征的参考区间,以期为本地区临床诊治工作提供可靠的参考依据。方法:通过问卷调查、体格... 详细信息

目的:通过检测吉首地区土家族、苗族、汉族健康成人的肝肾功能常用生化指标,分析指标在民族、性别、年龄层的差异,尝试初步建立符合吉首地区人群特征的参考区间,以期为本地区临床诊治工作提供可靠的参考依据。方法:通过问卷调查、体格检查、实验室辅助检查等方式,选择在吉首市人民医院体检的209岁健康个体,共计2173人。参照美国临床和实验室标准化研究院(CLSI)发布的C28-A3文件和我国卫生行业WS/T 402-2012标准文件分别建立TBIL、DBIL、TP、ALB、ALT、AST、TBA、UREA、CREA、UA的参考区间。运用SPSS 25.0软件中的非参数法进行数据统计、分析,根据结果按民族(苗族、土家族、汉族)、性别(男性、女性)、年龄层(209岁、409岁、609岁)分组。组内数据呈正态分布,参考区间为x±1.96s;组内数据呈偏态分布,用非参数法取中间95%数据为参考区间为(P,P)。用MedCalc 19.1.1软件计算参考区间上下限的90%置信区间(CI)。根据建立的参考区间分组情况,按组采用小样本验证方法(n=20例),进行参考区间适用性验证。结果:***、ALB、TBA、UREA、CREA、UA在民族间无统计学差异(p>0.05),但TBIL、DBIL、ALT、AST在民族间存在统计学差异(p0.05),但ALT、AST、UREA、CREA、UA在性别间存在统计学差异(p0.05),但AST、UREA、CREA、UA在不同年龄层存在统计学差异(p<0.05)。4.根据民族、性别、年龄层差异情况,分别建立项目参考区间。TBIL的参考区间(无性别、年龄差异):苗族、土家族为5.73.3μmol/L;汉族为4.42.6μmol/L。DBIL的参考区间(无性别、年龄差异):苗族、土家族为1.5.8μmol/L;汉族为1.5.0μmol/L。TP的参考区间为629 g/L(无民族、性别、年龄差异)。ALB的参考区间为373 g/L(无民族、性别、年龄差异)。TBA的参考区间为1.11.0μmol/L(无民族、性别、年龄差异)。UREA的参考区间(无民族间差异):男性,209岁为2.8.5μmol/L,409岁为2.8.5μmol/L;女性,209岁为2.0.7μmol/L,609岁为2.2.0μmol/L。CREA的参考区间(无民族间差异):男性,209岁为504μmol/L,409岁为559μmol/L,609岁为5303μmol/L;女性,209岁为396μmol/L,609岁为432μmol/L。UA的参考区间(无民族间差异):男性,209岁为20406μmol/L;女性,209岁为14452μmol/L,609岁为15062μmol/L。ALT的参考区间(无年龄差异):男性,苗族、土家族为114 U/L,汉族为96 U/L;女性为73 U/L(无民族间差异)。AST的参考区间:(1)苗族、土家族(无年龄差异),男性为148 U/L,女性为135 U/L。(2)汉族,男性,209岁为86 U/L,409岁为129 U/L;女性,209岁为67 U/L,409岁为95 U/L。5.肝肾功能常用生化指标的参考区间经小样本验证并通过。结论:1.吉首地区常用肝肾功能项目(ALT、AST、TBIL、DBIL、UREA、CREA、UA)有民族、性别、年龄差异。2.新建立的肝肾功能项目(ALT、AST、TBA、TP、ALB、TBIL、DBIL、UREA、CREA、UA)参考区间适用于吉首地区。

关键词：吉首地区土家族苗族汉族肝肾功能生化指标参考区间

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梅毒螺旋体脂蛋白Tp0768通过ER应激和ROS/NF-κB途径促进巨噬细胞分泌促炎细胞因子

梅毒螺旋体脂蛋白Tp0768通过ER应激和ROS/NF-κB途径促进巨噬细胞...

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作者：李维南华大学

学位级别：硕士

目的:本研究以巨噬细胞为靶细胞,探讨了感染依赖性抗原Tp0768的促炎机制,并筛选出Tp0768可能的炎症信号转导通路,为进一步揭示梅毒螺旋体的致病机制奠定基础。方法:1.用Tp0768刺激THP-1分化的巨噬细胞和Raw264.7细胞后,RT-qPCR检测IL-1... 详细信息

目的:本研究以巨噬细胞为靶细胞,探讨了感染依赖性抗原Tp0768的促炎机制,并筛选出Tp0768可能的炎症信号转导通路,为进一步揭示梅毒螺旋体的致病机制奠定基础。方法:1.用Tp0768刺激THP-1分化的巨噬细胞和Raw264.7细胞后,RT-qPCR检测IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达水平。***0768刺激细胞后,使用透射电子显微镜观察内质网结构变化。WesternBlot检测ER应激相关标志物PERK、Bip和IRE1α的表达水平。ER应激抑制剂4-PBA预处理细胞后RT-qPCR检测IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的水平。***0768刺激细胞后,使用流式细胞术和细胞免疫荧光分别检测了THP-1分化的巨噬细胞和Raw264.7细胞中的ROS水平。细胞免疫荧光和WesternBlot检测了NF-κBp65的核转位和蛋白表达水平。NF-κB的抑制剂预处理细胞后,RT-qPCR检测IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达水平。4.通过CCK8检测了PERK抑制剂GSK2656157的IC50。GSK2656157预处理细胞后,Western Blot检测PERK、NF-κB（P65）、JNK和P-JNK的蛋白水平。RT-qPCR检测经GSK2656157或SP600125预处理细胞后IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达水平。5.通过CCK8检测了IRE1α抑制剂STF-083010的IC50。STF-083010预处理细胞后,琼脂糖凝胶电泳检测XBP1的剪接,Western Blot检测IRE1α、JNK和P-JNK的蛋白水平。RT-qPCR检测经STF-083010或SP600125预处理细胞后IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达水平。结果:***0768刺激巨噬细胞可导致IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达水平以剂量和时间依赖性方式增加。***0768刺激细胞后内质网扩张、肿胀以及正常折叠结构消失。PERK、Bip和IRE1α的蛋白表达水平上调。ER应激抑制剂4-PBA预处理细胞后能够显著降低Tp0768诱导的IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA水平（P＜0.05）。***0768刺激后可显着诱导细胞内ROS产生,使用4-PBA干预后可显著降低Tp0768诱导的细胞内ROS的水平（P＜0.05）。NF-κBp65的蛋白质水平以剂量依赖性上调并发生核转位。抑制NF-κB途径可降低TP0768诱导的IL-1β、IL-6和IL-8的表达（P＜0.05）。***-1分化的巨噬细胞和Raw264.7细胞中GSK2656157的IC50分别为12.56μM和13.87μM。PERK途径被抑制可以显著抑制NF-κB（P65）和JNK通路。SP600125预处理后减弱了TP0768诱导的IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达（P＜0.05）。***-1分化的巨噬细胞的IC50为24.72μM,Raw264.7细胞的IC50为13.89μM。20μM STF-083010干预可显著抑制TP0768诱导的XBP1 mRNA的剪接和XBP1s的产生。IRE1α信号传导的抑制降低磷酸化JNK水平。使用SP600125抑制JNK激酶活性,IL-1β、IL-6和IL-8的转录被显着抑制（P＜0.05）。结论:1.重组梅毒螺旋体蛋白Tp0768通过ER应激和ROS/NF-κB途径促进THP-1分化的巨噬细胞和Raw264.7细胞诱导促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的产生。***应激参与Tp0768诱导的促炎细胞因子的表达经由PERK途径和IRE1α/XBP1途径诱导,其中还涉及到下游通路NF-κB和JNK通路的激活。

关键词：梅毒螺旋体 Tp0768 ER应激 ROS/NF-κB途径巨噬细胞

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糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机的初步探讨

糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机的初步探讨

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作者：易婷南华大学

学位级别：硕士

目的:通过构建糖尿病兔、梅毒兔、糖尿病合并梅毒兔模型后,对比各实验组兔肾组织钙化情况并通过基因芯片筛选肾组织中与之相关的差异表达基因,再检测肾组织中钙化相关差异基因的蛋白表达情况,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机制。... 详细信息

目的:通过构建糖尿病兔、梅毒兔、糖尿病合并梅毒兔模型后,对比各实验组兔肾组织钙化情况并通过基因芯片筛选肾组织中与之相关的差异表达基因,再检测肾组织中钙化相关差异基因的蛋白表达情况,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机制。方法:1.实验动物分组及建模:将新西兰雄兔随机分成四组并构建正常组(C组)、糖尿病组(DM组)、梅毒组(TP组)和糖尿病合并梅毒组(H组)模型。***染色:取各组兔肾组织石蜡切片脱蜡水化后用苏木精浸染,盐酸酒精分化,弱氨水返蓝和乙醇及二甲苯脱水最后中性树胶封片,观察各组实验兔肾组织的钙化情况。3.基因芯片检测:取各实验组兔肾组织进行基因芯片检测,筛选出差异表达的钙化相关基因。4.钙化相关差异基因的PCR检测:m RNA实时定量PCR检测各组实验兔肾组织中钙化相关基因表达的相对含量。5.钙化相关差异基因蛋白表达的免疫印迹(Western blot,WB)检测:提取肾脏组织蛋白测定浓度,配平后上样跑胶,0.05A恒流转膜45分钟,再用牛奶封闭1小时,孵一抗4度过夜,将膜放入TBST溶液洗膜后放入温箱孵二抗1小时,洗膜后显影,检测各组兔肾组织钙化相关差异基因蛋白的表达情况。6.免疫组化检测:取肾组织石蜡切片脱蜡水化,用3%过氧化氢(H2O2)去离子水孵育后用水冲洗PBS浸泡,通过5-10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭后再滴加一抗放入4度过夜之后用PBS冲洗,滴加二抗孵育后PBS冲洗,再滴加聚合物增强剂孵育后继续用PBS冲洗,显色后水洗然后复染、脱水、透明,最后封片。结果:1、糖尿病组(DM组)兔、梅毒组(TP组)兔和糖尿病合并梅毒组(H组)兔建模成功。2、HE染色结果显示:正常组兔肾组织没有明显的异常改变,TP组、DM组和H组实验兔肾组织均可见肾小球毛细血管扩张和近曲小管肿胀。并且DM组实验兔肾组织中集合管内和肾髓质区还可见蛋白管型、间质粘液样变、水泡样变。H组实验兔中肾近曲小管肿胀和肾小球毛细血管扩张更为严重,肾组织内钙盐沉积明显。3、基因芯片结果显示:肾上腺素受体α1A(ADRA1A)、R型电压依赖性钙通道Ca V2.3(CACNA1E)、胆囊收缩素A受体(CCKAR)基因在各实验组兔肾组织中的差异显著,与正常组相比,ADRA1A、CACNA1E、CCKAR基因含量在TP、DM、H组肾脏中上调,在TP组少量上调,DM组上调明显,H组上调最高。4、ADRA1A、CACNA1E、CCKAR基因m RNA实时定量PCR结果显示:与C组相比,ADRA1A、CACNA1E基因在TP、DM、H组肾脏中的表达量均上调,DM、H组的表达量比TP组高,H组中的表达量最高(其PCR表达量趋势与基因芯片结果相符)。与C组相比,CCKAR基因在TP、DM、H组肾脏中的表达含量均上调,DM、H组中的表达量比TP组高,但H组与DM组相比表达无差异。Toll样受体4(TLR-4)和丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)基因m RNA实时定量PCR结果显示:与C组比较,其m RNA水平在TP、DM、H组肾脏中均有上调,而H组上调最为明显,与ADRA1A、CACNA1E的表达趋势一致。5、WB检测:ADRA1A、CACNA1E、CCKAR和TLR-4、MAPK1基因的蛋白表达水平与m RNA实时定量PCR结果相符,以H组的表达水平最高。6、免疫组化结果显示:与C组正常兔相比,ADRA1A、CACNA1E、CCKAR、TLR-4和MAPK1基因在TP组、DM组、H组中的阳性细胞增多;H组中阳性细胞最多,其次为DM组;TP组则只有少量的表达,C组阳性细胞表达量最少。结论:1.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的炎症反应和肾脏钙化更严重。2.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的肾脏钙化加重可能与ADRA1A和CACNA1E受体表达上调介导钙内流增加有关;可能与CCKAR基因的表达上调无关。3.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的肾脏钙化加重可能与TLR-4受体和MAPK1基因表达上调介导的炎症反应增加有关。

关键词：糖尿病合并梅毒钙化 ADRA1A CACNA1E CCKAR TLR-4 MAPK1

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梅毒螺旋体TpF-1蛋白经ERS/PI3K/AKT和ROS/NF-κB途径上调IL-6、IL-8促进内皮细胞成管

梅毒螺旋体TpF-1蛋白经ERS/PI3K/AKT和ROS/NF-κB途径上调IL-6、I...

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作者：蔡佳伦南华大学

学位级别：硕士

目的本研究以人脐静脉血管内皮细胞为靶细胞,研究梅毒螺旋体重组蛋白Tp F-1在促进血管生成中的作用,并进一步探讨ERS/PI3K/AKT和ROS/NF-κB信号通路在Tp F-1促血管生成中的作用机制,为研究梅毒螺旋体感染引起的血管生成和血管炎症奠定... 详细信息

目的本研究以人脐静脉血管内皮细胞为靶细胞,研究梅毒螺旋体重组蛋白Tp F-1在促进血管生成中的作用,并进一步探讨ERS/PI3K/AKT和ROS/NF-κB信号通路在Tp F-1促血管生成中的作用机制,为研究梅毒螺旋体感染引起的血管生成和血管炎症奠定基础。实验方法1.通过体外血管形成实验检测不同浓度TPF-1刺激内皮细胞各组细胞形成血管的能力;采用CCK-8法检测内皮细胞的增殖和存活能力;2.采用RT-q PCR实验和ELISA实验检测各组内皮细胞IL-6、IL-8的表达水平;3.采用透射电子显微镜观察细胞内内质网结构的改变,Western Blot实验检测各组细胞ERS、PI3K/AKT通路相关蛋白的表达情况;通过免疫荧光实验检测内皮细胞在Tp F-1刺激下发生核转位的情况,Western blot检测NF-κB信号通路P-65蛋白的变化;4.在加入TPF-1蛋白处理后的内皮细胞上清中加入ERS、PI3K/AKT、ROS、NF-κB抑制剂(4-PBA、GSK2656157、STF-083010、LY294002、NAC),通过Western Blot实验检测抑制剂处理组细胞通路相关蛋白的表达情况;通过流式细胞仪检测内皮细胞ROS的表达情况;通过CCK-8实验进一步观察ERS、PI3K、ROS相关抑制剂的加入是否会对TPF-1刺激后的HUVEC细胞活性产生影响;5.通过Transwell实验和内皮细胞成管实验观察ERS、PI3K/AKT、ROS相关抑制剂的加入是否会对Tp F-1处理后的HUVEC成管能力和迁移能力产生影响。结果*** F-1刺激HUVEC浓度分别为0、1.5、3、6、12(μg/m L),刺激18h后发现Tp F-1刺激浓度为6(μg/m L)时开始促进HUVEC的血管生成,而在Tp F-1的浓度达到12(μg/m L)时诱导血管生成的现象最明显;CCK-8结果显示随着Tp F-1蛋白浓度的增加,HUVEC的细胞活性也逐渐增高,且具有统计学意义;2.不同浓度的Tp F-1刺激HUVEC后细胞因子IL-6、IL-8的表达量以剂量依赖性方式增加,而VEGF的表达量改变不显著;3.通过透射电子显微镜观察发现,加入Tp F-1刺激组的细胞内质网结构明显肿胀且内质网结构发生断裂,Western Blot结果也显示Tp F-1刺激HUVEC后内质网应激相关蛋白明显上调,且具有剂量依赖性;4.通过加入ERS、PI3K/AKT抑制剂(4-PBA、GSK2656157、STF-083010、LY294002)后观察到ERS和PI3K通路相关蛋白得到了明显的抑制作用且ERS通路可抑制下游PI3K/AKT通路相关蛋白的表达,且均抑制了IL-6、IL-8的表达;5.通过体外成管实验显示,加入ERS和NAC抑制剂后血管生成能力明显降低;***-8结果显示与未加抑制剂的细胞相比,加入ERS、ROS、PI3K抑制剂处理后的细胞细胞活性明显降低,但相对于PBS处理组细胞的活性变化无统计学意义;7.免疫荧光结果显示TpF-1蛋白处理后的细胞发生了核转位的情况,且Western Blot结果显示NF-κB相关蛋白,相较未加蛋白刺激组表达明显增高。结论*** F-1可以促进内皮细胞分泌IL-6、IL-8诱导血管生成。*** F-1可通过ERS/PI3K/AKT途径促进内皮细胞管形成。*** F-1可通过和ROS/NF-κB途径诱导内皮细胞管形成。

关键词：血管生成梅毒螺旋体 TpF-1 内质网应激氧化应激

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梅毒螺旋体金属蛋白酶的表达及对纤维蛋白原水解活性研究

梅毒螺旋体金属蛋白酶的表达及对纤维蛋白原水解活性研究

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作者：刘琼南华大学

学位级别：硕士

目的:研究梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质(ECM)纤维蛋白原(Fg)的水解能力及其机制,为深入研究Tp的致病机制提供实验依据。方法:(1)Tp0751野生型和突变型蛋白原核表达、纯化:从Genbank上查获Tp0751的基... 详细信息

目的:研究梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质(ECM)纤维蛋白原(Fg)的水解能力及其机制,为深入研究Tp的致病机制提供实验依据。方法:(1)Tp0751野生型和突变型蛋白原核表达、纯化:从Genbank上查获Tp0751的基因序列(不含信号肽氨基酸编码序列),构建野生型p ET30a(+)/Tp0751、p ET30a(+)/Tp0751 H198A突变型和p ET30a(+)/Tp0751 H202A突变型蛋白原核表达重组载体,重组质粒在经双酶切、PCR和测序鉴定后被转化到BL21表达菌中进行重组蛋白的诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定经Ni-NTA纯化的目的蛋白的表达形式,BCA法测定蛋白的浓度;Western blot鉴定经Ni-NTA纯化的目的蛋白。(2)野生型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。(3)H198A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将H198A突变型Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测H198A突变型Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。(4)H202A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:将H202A突变型Tp0751蛋白与Fg按比例混合(蛋白终质量为30μg,Fg终质量为60μg,反应总体积为100μL),SDS-PAGE检测H202A突变型Tp0751对Fg不同作用时间段的降解活性。结果:(1)Tp0751蛋白原核表达、纯化:酶切及测序结果表明重组野生型p ET30a(+)/Tp0751质粒的插入片段序列与Gen Bank上面公布的序列完全一致,经两点法构建的突变型重组质粒构建成功;该插入片段能够表达26KDa大小的可溶性重组蛋白,该重组蛋白经纯化后的纯度达到90%;该重组蛋白的Western blot结果表明,其与梅毒阳性病人的免疫血清产生特异性的免疫反应。(2)Tp0751蛋白对Fg水解能力检测:Tp0751蛋白具有水解Fg的能力,在反应持续24小时后Fg基本上被水解完全。(3)H198A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:H198A突变型Tp0751蛋白具有一定的水解Fg能力,在反应持续24小时后Fg部分被水解。(4)H202A突变型Tp0751蛋白体外水解人Fg能力检测:H202A突变型Tp0751未表现出明显的水解Fg的能力,在反应持续24小时后Fg基本未被水解。结论:(1)Tp0751重组蛋白具有水解Fg的能力;(2)Tp0751蛋白HEXXH域的突变能抑制Tp0751蛋白降解Fg的能力;H198EXXH202结构域中影响Tp0751蛋白降解Fg的位点可能是202位的H而不是198位的H。

关键词：梅毒螺旋体金属蛋白酶 Tp0751 水解活性致病机制

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湖南地区耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药情况及耐药机制研究

湖南地区耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药情况及耐药机制研究

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作者：罗椿意南华大学

学位级别：硕士

目的:本研究收集湖南省多家医院的CRKP临床分离株,对其进行鉴定、药敏分析和耐药基因筛查,了解湖南省CRKP流行的耐药基因型及其对常见抗菌药物的耐药情况,并进一步分析和探讨CRKP可能存在的耐药机制,为临床医师合理使用抗菌药物及控制... 详细信息

目的:本研究收集湖南省多家医院的CRKP临床分离株,对其进行鉴定、药敏分析和耐药基因筛查,了解湖南省CRKP流行的耐药基因型及其对常见抗菌药物的耐药情况,并进一步分析和探讨CRKP可能存在的耐药机制,为临床医师合理使用抗菌药物及控制院内感染提供理论依据。方法:1.收集2019年5月-2020年11月期间来自湖南省衡阳、长沙、湘潭和怀化地区的CRKP菌株共96株,对CRKP菌株的科室、性别、年龄分布等情况进行统计分析。2.利用拉丝实验筛检96株CRKP菌株中的高黏液型CRKP菌株,对CRKP菌株进行初步的鉴别分析。3.使用法国梅里埃VITEK 2 COMPACT微生物分析系统进行药敏分析、菌种鉴定。肉汤稀释法确定常见抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。纸片扩散法（KB法）补充验证96株CRKP菌株的药物敏感性结果。4.通过mCIM联合eCIM试验检测96株CRKP菌株的碳青霉烯酶表型。使用PCR分子学方法检测CRKP菌株的相关耐药基因,包括碳青霉烯类耐药基因（KPC、NDM、VIM、OXA-48）、多粘菌素B耐药基因（MCR-1）及外膜孔蛋白基因（Ompk35及Ompk36）,同时测序鉴定检出的耐药基因。结果:1.医院收集的96株CRKP菌株主要分离自痰液标本55.21%（53/96）、尿液标本14.58%（14/96）和血液标本11.46%（11/96）。临床科室分布主要为ICU 40.63%（39/96）、神经外科18.75%（18/96）和神经内科8.33%（8/96）。CRKP菌株来自的患者中,男性分离率67.71%（65/96）高于女性32.29%（31/96）。年龄分布主要集中在21-90岁之间,其中以61-70岁之间的分离率最高,为21.88%（21/96）。2.96株CRKP菌株通过拉丝试验筛检高黏液表型CRKP菌株的阳性率为14.43%（14/96）。3.96株CRKP菌株分别对26种常见的抗菌药物进行耐药检测,结果显示CRKP菌株对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、厄他培南耐药率均为100%（96/96）。26种抗菌药物的耐药率均在50%以上,其中对青霉素类抗生素氨苄西林、美洛西林、阿莫西林、羧苄西林以及内酰胺酶联合抑制剂氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸的耐药率均为100%（96/96）。对多种头孢菌素类抗生素如头孢曲松、头孢呋辛、头孢替坦、头孢他啶和头孢吡肟的耐药率高达90%。氨基糖苷类如阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的耐药率相对较低,分别为61.46%（59/96）、68.75%（66/96）、62.5%（60/96）。4.96株CRKP菌株进行mCIM和eCIM联合试验,mCIM试验单独阳性率为79.17%（76/96）,mCIM和eCIM试验均阳性率为16.67%（16/96）,提示本研究中CRKP菌株主要以产丝氨酸酶为主。5.通过PCR技术对CRKP菌株进行耐药基因检测,结果显示96株CRKP菌株检测到KPC基因有95株（98.96%）,NDM有17株（17.71%）,VIM有9株（9.38%）,OXA-48有18株（18.75%）。同时检测到KPC和NDM基因有16株（16.67%）,KPC和VIM基因有9株（9.38%）,KPC和OXA-48基因有17株（17.71%）,NDM和VIM基因有3株（3.12%）,NDM和OXA-48基因有5株（5.21%）,VIM和OXA-48基因有2株（2.08%）。同时检测到KPC、NDM和VIM基因有3株（3.12%）,KPC、NDM和OXA-48基因有4株（4.17%）,NDM、VIM和OXA-48基因有1株（1.04%）,同时检出KPC、NDM、VIM、OXA-48基因型有1株,所有检出基因经基因测序验证为目的基因。6.多粘菌素B耐药MCR-1基因PCR实验结果显示本研究检测到MCR-1基因的CRKP菌株有34株（35.42%）,所有检出基因经基因测序验证为目的基因。7.96株CRKP菌株均检测到外膜孔道蛋白Ompk35基因,同时检测到Ompk36基因有91株,有5株（5.21%）存在外膜孔道蛋白Ompk36基因缺失,所有检出基因经基因测序验证为目的基因。结论:1.湖南省多家医院收集的96株CRKP菌株,其主要来源于痰液标本,临床科室主要集中分布于ICU,男性较女性的分离率高,高黏液型CRKP菌株的阳性率较高,需加强对重点科室和重点人群的监测,控制院内感染。2.本次收集的CRKP菌株以产丝氨酸酶为主,且对多种常用的抗菌药物耐药,耐药机制主要以产生KPC耐药基因为主,同时存在Ompk36基因缺失,多粘菌素B耐药MCR-1基因阳性率亦较高。

关键词：肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶多粘菌素外膜孔蛋白基因

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克山县黑土玉米优化施肥技术研究

克山县黑土玉米优化施肥技术研究

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作者：王世平中国农业科学院

学位级别：硕士

本研究主要是针对克山县气候冷凉、作物生育期短、作物生长前期土壤养分有效性差的特点，通过研究优化施肥技术对黑土区玉米生长发育特征、产量效益等方面影响效果，明确最佳施肥时期和施肥量，寻找克山县不同地区玉米生产适宜的施肥方... 详细信息

本研究主要是针对克山县气候冷凉、作物生育期短、作物生长前期土壤养分有效性差的特点，通过研究优化施肥技术对黑土区玉米生长发育特征、产量效益等方面影响效果，明确最佳施肥时期和施肥量，寻找克山县不同地区玉米生产适宜的施肥方式，以达到节本增效，提高玉米产量、品质，增加农民收入的目的。主要研究结果如下： 1.玉米生产氮肥仍然是高产的关键，氮肥对玉米生长发育和产量有明显的促进作用，玉米氮的适宜用量为N100-150kg/hm2。 2.磷肥对玉米生长发育及产量有显著正效应，施磷肥在P2O545-180kg/hm2范围内，从产量、经济效益和施肥风险综合考虑，磷的推荐用量为，即P2O590kg/hm2。 3.施钾处理较不施钾处理显著提高玉米产量，平均增产889kg/hm2，平均增产率12.3%，每公斤K2O平均增产玉米7.9kg，平均增收388元/hm2。从玉米产量和效益方面综合考虑，玉米钾的推荐用量为K22O75kg/hm。 4.平衡施肥对玉米产量和经济效益有明显的促进作用。不施氮肥平均少收入1307元/hm2，不施磷肥少收入564元/hm2，不施钾肥少收入740元/hm2，不施硫肥少收入322元/hm2，不施微量元素锌经济效益显著下降，比OPT处理平均少收入699元/hm2，不施肥处理玉米产量低，比OPT处理少收入439元/hm2。 5.氮肥用量为100%的各处理玉米产量均较高。以BU (40%B+60%T)处理产量最高，普通尿素与控释尿素混搭基施，与追肥一次玉米产量效果相当。玉米地上部氮素吸收趋势与产量趋势相似。以100%氮肥用量的各处理氮素吸收均较高，施氮量降低则氮素吸收降低。土壤0-90cm矿质氮残留总体表现为随着土层深度的增加而降低，随着施氮量的增加而增加。在100%施氮量的4个处理中，以BU (40%B+60%T)处理残留最小，其次为(40%BU+60%CRU)B。

关键词：克山县黑土玉米优化施肥

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