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MCF-7细胞中CLDN6靶基因的筛选及CLDN6通过Tyk-2/Stats通路影响MCF-7细胞的恶性表型

MCF-7细胞中CLDN6靶基因的筛选及CLDN6通过Tyk-2/Stats通路影响MC...

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作者：张婷吉林大学

学位级别：硕士

目的：利用基因芯片技术筛查乳腺癌细胞MCF-7中乳腺癌抑制基因CLDN6的下游靶基因，探讨CLDN6活化Tyk-2/Stats信号通路对MCF-7细胞恶性表型的作用及其机制。方法：用基因芯片技术筛查过表达CLDN6的MCF-7细胞（3个克隆）与空载组中差异... 详细信息

目的：利用基因芯片技术筛查乳腺癌细胞MCF-7中乳腺癌抑制基因CLDN6的下游靶基因，探讨CLDN6活化Tyk-2/Stats信号通路对MCF-7细胞恶性表型的作用及其机制。方法：用基因芯片技术筛查过表达CLDN6的MCF-7细胞（3个克隆）与空载组中差异表达的基因;采用RT-PCR方法验证芯片结果的准确性;生物信息学方法分析CLDN6的下游靶基因及相关的信号通路;WesternBlot技术验证Tyk-2/Stats信号通路中Tyk-2、Stat-1、Stat-3和Stat-4的总蛋白表达及磷酸化水平;WesternBlot技术检测酪氨酸酶抑制剂AG490抑制Stats磷酸化的最佳浓度和最佳时间;MTT法、划痕实验及侵袭实验分别检测AG490对过表达CLDN6的MCF-7细胞增殖能力、体外迁移能力及体外侵袭能力的影响。结果：过表达CLDN6的MCF-7细胞（3个克隆）与空载组相比，共同差异表达的基因有76个，其中包括54个上调基因和22个下调基因;RT-PCR法验证部分差异表达基因，其结果与芯片结果一致;生物信息学分析发现，Tyk-2/Stats信号通路在过表达CLDN6的MCF-7细胞中活化;WesternBlot法证实过表达CLDN6的MCF-7细胞中Tyk-2、Stat-1、Stat-3和Stat-4的磷酸化水平明显升高;AG490抑制Stats磷酸化的最佳浓度和时间分别为25μM和16h;AG490处理后，过表达CLDN6的MCF-7细胞增殖和迁移能力增强，侵袭能力无明显变化。结论：乳腺癌抑制基因CLDN6对乳腺癌细胞MCF-7恶性表型的抑制作用与其下游靶基因的活化有关，Tyk-2/Stats信号通路的活化在CLDN6基因抑制乳腺癌细胞恶性表型过程中发挥重要作用。

关键词：乳腺癌基因芯片紧密连接信号转导

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氯胺酮对发育期大鼠的认知功能及大脑海马区nNOS表达的影响

氯胺酮对发育期大鼠的认知功能及大脑海马区nNOS表达的影响

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作者：苑韬吉林大学

学位级别：硕士

本研究采用Y-迷宫测试及免疫组织化学染色法观察氯胺酮对发育期大鼠学习记忆功能及大脑海马区nNOS表达的影响,初步探讨氯胺酮对大鼠学习记忆功能的影响及其作用机制。本实验通过对随机分组的SD大鼠腹腔注射不同剂量的氯胺酮建立全身麻... 详细信息

本研究采用Y-迷宫测试及免疫组织化学染色法观察氯胺酮对发育期大鼠学习记忆功能及大脑海马区nNOS表达的影响,初步探讨氯胺酮对大鼠学习记忆功能的影响及其作用机制。本实验通过对随机分组的SD大鼠腹腔注射不同剂量的氯胺酮建立全身麻醉动物实验模型,采用Y-迷宫行为学测试法观察和记录达标所需训练次数、正确反应率及主动回避率作为学习记忆功能的评估指标;行为学测试完成后采用免疫组织化学染色法检测各组大鼠海马区nNOS的表达情况。氯胺酮麻醉期间各组SD大鼠的脉搏、氧饱和度等生命体征基本稳定;Y-迷宫测试学习记忆功能结果显示,达标所需训练次数、正确反应率和主动回避率在低剂量组和训练组之间比较差异无显著性;高剂量组达标所需训练次数明显高于其他组(除第4天外);高剂量组正确反应率明显低于其他组;高剂量组主动回避率明显低于训练组,但与低剂量组相比差异无显著性。免疫组织化学染色结果显示空白组nNOS基本无表达,高剂量组nNOS表达明显低于训练组和低剂量组,低剂量组与训练组相比无明显差异。实验证明,多次高剂量氯胺酮注射麻醉对发育期大鼠的学习记忆功能具有损害作用,这种损害作用可能与大脑海马区nNOS表达的抑制有关。

关键词：氯胺酮认知功能海马神经型一氧化氮合酶

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CLDN6通过ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1抑制乳腺癌细胞增殖的作用

CLDN6通过ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1抑制乳腺癌细胞增殖的作用

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作者：邵忆佳吉林大学

学位级别：硕士

乳腺癌细胞的增殖过程受细胞间的紧密连接(Tight Junctions,TJs)调节。TJs通过不同的分子机制影响上皮细胞增殖能力。Claudins(CLDNs)是TJs的主要成分,具有4个跨膜区,并含有一个PDZ结构域的羧基末端,通过该结构域与多种同样含有PDZ结构... 详细信息

乳腺癌细胞的增殖过程受细胞间的紧密连接(Tight Junctions,TJs)调节。TJs通过不同的分子机制影响上皮细胞增殖能力。Claudins(CLDNs)是TJs的主要成分,具有4个跨膜区,并含有一个PDZ结构域的羧基末端,通过该结构域与多种同样含有PDZ结构域的信号蛋白结合,参与信号通路调节,其中包括与细胞增殖分化相关的ERK信号通路,ERK信号通路作用于下游蛋白,如cyclin D1,影响细胞增殖能力。然而,CLDNs如何通过ERK信号通路靶向下游蛋白进而调控细胞增殖的具体作用机制尚不清楚。本课题组前期工作结果表明,在乳腺癌细胞中CLDN6表达下调,过表达CLDN6抑制细胞的增殖能力。根据高通量基因测序结果显示,过表达CLDN6,cyclin D1的表达下调。本课题通过预实验验证,在乳腺癌细胞中过表达CLDN6,cyclin D1表达下调,与测序结果一致。由此我们认为,CLDN6抑制乳腺癌细胞的增殖能力可能与抑制cyclin D1的表达相关。Cyclin D1是细胞周期蛋白中的一种,其启动子区含有多种转录因子的结合位点,其中包括转录因子Sp1,Sp1与cyclin D1启动子区的结合位点结合后,可以促进cyclin D1的转录水平,进而调控细胞的增殖能力。Sp1属于Sp/KLF锌指家族,是人体细胞中重要的转录调控因子,作为主要的GC盒转录因子参与调控靶基因的表达。Sp1靶向调控多种蛋白,同时也受很多蛋白和信号通路的调控,包括ERK信号通路。有研究显示,ERK信号通路激活后,Sp1表达上调。ERK-Sp1信号通路在很多肿瘤生长增殖过程中发挥作用。课题组前期工作中发现,在宫颈癌细胞中,CLDN6通过PDZ结构域与AF6结合,抑制了AF6与Ras的结合,竞争性地抑制了Ras和Raf的结合,进而抑制ERK信号通路的激活。由此我们推测:CLDN6可能通过ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖能力。目的:探讨CLDN6通过ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1表达抑制乳腺癌细胞增殖能力的作用机制,为靶向CLDN6的乳腺癌治疗提供实验依据。方法:以前期工作中所获得的稳定过表达CLDN6基因的人乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-231(克隆组);转染空载pc DNA3.1质粒的MCF-7及MDA-MB-231细胞(空载组)为研究对象:RT-PCR和Western-Blot法鉴定CLDN6的表达1.过表达CLDN6抑制乳腺癌细胞的增殖能力CCK8实验和克隆形成实验检测CLDN6对细胞增殖能力的影响。***1在CLDN6抑制cyclin D1表达中的作用Western-Blot法检测Sp1及cyclin D1的表达;在过表达CLDN6细胞中瞬时转染Sp1质粒并通过RT-PCR和Western-Blot法对Sp1表达鉴定;Western-Blot检测转染Sp1后cyclin D1的蛋白表达。***在CLDN6下调cyclin D1抑制乳腺癌细胞增殖中的作用Western-Blot检测过表达CLDN6细胞中ERK的磷酸化水平;Western-Blot检测ERK激动剂PMA处理细胞的最佳作用浓度,及处理细胞后Sp1、cyclin D1的蛋白表达水平;CCK8法和克隆形成实验检测PMA处理对细胞增殖能力的影响。CCK8法检测Sp1抑制剂MTM的IC50值;Western-Blot法检测MTM处理细胞的最佳作用浓度和时间;Western-Blot法检测ERK信号通路激活并抑制Sp1后cyclin D1的表达;CCK8法和克隆形成实验检测ERK信号通路激活并抑制Sp1后对细胞增殖能力的影响。结果:1.过表达CLDN6抑制乳腺癌细胞的增殖能力CCK8结果显示,第3天时,MCF-7克隆组细胞的细胞活力低于空载组,MDA-MB-231克隆组细胞在第4天时,细胞活力低于空载组;克隆形成实验结果显示,两组克隆组细胞克隆形成的数量低于空载组细胞。结果提示,CLDN6降低细胞活力,抑制乳腺癌细胞的增殖能力。***1在CLDN6抑制cyclin D1表达中的作用Western-Blot结果显示,过表达CLDN6细胞中Sp1及cyclin D1表达水平低于空载组;瞬时转染Sp1,Western-Blot结果显示转染组细胞中的Sp1的m RNA和蛋白水平高于未转染Sp1组;转染组细胞中的cyclin D1表达水平高于未转染组。结果提示,CLDN6可能通过抑制Sp1下调cyclin D1的表达。***在CLDN6下调cyclin D1抑制乳腺癌细胞增殖中的作用Western-Blot结果显示,克隆组细胞中ERK的磷酸化水平低于空载组,ERK的总蛋白水平不变;Western-Blot结果显示ERK激动剂PMA处理细

关键词：乳腺癌细胞 CLDN6 ERK Sp1 cyclin D1 细胞增殖

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