检索结果-南通市图书馆

作者：肖毅中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

背景与目的：人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscrip tase, hTERT)是端粒酶复合物的核心成分,其表达状态是细胞调控端粒酶活性的重要环节。hTERT是最早发现,也是目前研究较多的广谱肿瘤相关抗原(TAA)之一。已经证实在85... 详细信息

背景与目的：人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscrip tase, hTERT)是端粒酶复合物的核心成分,其表达状态是细胞调控端粒酶活性的重要环节。hTERT是最早发现,也是目前研究较多的广谱肿瘤相关抗原(TAA)之一。已经证实在85%以上的人类恶性肿瘤细胞中均存在hTERT的再激活,并且在肿瘤的发生发展过程中发挥关键作用。hTERT的广泛表达使其成为肿瘤治疗的理想靶点。本研究通过特异性扩增hTERT基因,成功构建了hTERT新型基因疫苗,并且建立了稳定表达hTERT的B16细胞系。为进一步研究hTERT基因疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。方法：通过RT-PCR的方法从人前列腺癌细胞系PC-3M中特异性扩增hTERT基因,连接到真核表达载体pIRES-neo中,构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT。脂质体法瞬时转染B16细胞,通过G418加压筛选单克隆细胞系,用western blot及免疫荧光和流式细胞术分别检测B16细胞中hTERT基因的蛋白表达。扩增出hTERT基因片段eTERT (1609bp-2628bp),连接到真核表达载体pVAX1-IRES中,构建hTERT广谱抗肿瘤基因疫苗pVAX1-eTERTFcGB,脂质体法瞬时转染293T细胞,通过免疫荧光和流式细胞术检测其表达情况。结果：特异性扩增得到大小与人hTERT基因相符的基因片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致;成功构建真核表达质粒pIRES-neo-hTERT。质粒成功转染B16细胞,经加压筛选,得到稳定表达hTERT的B16细胞系。成功扩增出hTERT基因片段eTERT (1609bp-2628bp),并构建hTERT广谱抗肿瘤基因疫苗pVAX1-eTERTFcGB,流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组基因疫苗质粒pVAX1-eTERTFcGB在293T细胞中得到很好的表达。结论：特异性扩增出hTERT基因,成功构建真核表达载体并筛选出稳定表达hTERT的B16细胞系;成功构建hTERT广谱抗肿瘤基因疫苗pVAXl-eTERTFcGB,为进一步研究hTERT基因疫苗的体内外免疫功能奠定了基础。

关键词：广谱肿瘤抗原 hTERT 基因疫苗 B16 免疫治疗

免疫增效型广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗的基础研究

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免疫增效型广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗的基础研究

作者：王伟中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

背景与目的：上世纪70年代由Judah Folkman提出的有关肿瘤血管生成的理论已被广泛接受,目前,抗肿瘤血管生成已经成为肿瘤学基础研究及临床治疗领域中最有前景的策略之一。大量研究证据表明,在众多的血管生成刺激因子中,内皮生长因子(VE... 详细信息

背景与目的：上世纪70年代由Judah Folkman提出的有关肿瘤血管生成的理论已被广泛接受,目前,抗肿瘤血管生成已经成为肿瘤学基础研究及临床治疗领域中最有前景的策略之一。大量研究证据表明,在众多的血管生成刺激因子中,内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR2(鼠中称为flk-1,人中称为KDR)对于与肿瘤生长及转移密切相关的血管生成是最重要的,许多旨在通过打破VEGF/VEGFR2传导通路抑制肿瘤血管生成的主动免疫实验研究都取得了比较理想的结果,还有研究表明,与全长基因疫苗相比,编码VEGFR2胞外1-4区的基因疫苗同样能够有效降低小鼠血清中VEGF水平,从而抑制肿瘤的生长及转移。构建一种能够诱导有效免疫反应基因疫苗的关键是打破对靶抗原的自身免疫耐受,在这项研究中我们主要采取三项措施解决这一问题。首先,选取异种同源的小鼠VEGFR2胞外1-4 IgG样区域(简称mVEGFR2(1-4))作为疫苗的靶抗原;其次,将人白细胞介素12(hIL-12)融合基因插入到载体IRES序列的下游,构建一个下游可以同时表达hIL-12双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12,hIL-12作为对体内细胞和体液免疫系统作用最强的免疫活性因子及一种抗血管生成因子,在基因疫苗中以免疫佐剂的形式发挥作用;最后,为了增强本疫苗的免疫粘附及抗原递呈功能,本研究利用真核表达载体pCI-Fc-GPI,实现了人Igk前导信号肽、人IgG-Fc段及GPI与靶抗原mVEGFR2(1-4)的共同表达,成功构建了免疫增效型广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗pVAX1-sig-mVEGFR2(1-4)-Fc-GPI-IRES-hIL 12(简称pVAX1-mVEGFR2-hIL12)。方法：通过搭桥PCR获得人白细胞介素12 P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入已构建好的DNA疫苗载体pVAX1-IRES下游,构建质粒载体pVAX1-IRES-hIL12;通过RT-PCR的方法从Balb/c小鼠胚胎组织中特异性扩增mVEGFR2(1-4)基因,连接到真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12的上游,构建基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。脂质体法瞬时转染293T细胞,用ELISA、免疫荧光和流式细胞术分别检测293T细胞中hIL-12和mVEGFR2(1-4)基因的蛋白表达。结果：特异性扩增得到大小与mVEGFR2(1-4)基因相符的基因片段,序列测定证实与GenBank(GI:57923)上登录的序列一致;酶切鉴定和序列分析表明P35及P40双亚基融合基因P35-F2A-P40与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达;成功构建了广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。FACS及IMF检测证实重组基因疫苗得到有效表达。结论：成功构建了免疫增效型广谱抗肿瘤血管基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12,为后续研究中进一步评价该疫苗抗肿瘤血管生成的效果奠定了必要基础,并为肿瘤免疫治疗领域提供了一种新的疫苗研究方向。

关键词：广谱肿瘤抗原小鼠VEGFR2 人白介素12 基因疫苗

抗前列腺癌可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的基础研究

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抗前列腺癌可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的基础研究

作者：任杰中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

背景与目的：人前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)高表达于进展期前列腺癌组织及前列腺癌转移灶,与前列腺癌发生、发展密切相关,在前列腺癌诊断和治疗研究中备受重视。本研究选择人PSCA作为免疫治疗的靶点,以塞姆利... 详细信息

背景与目的：人前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)高表达于进展期前列腺癌组织及前列腺癌转移灶,与前列腺癌发生、发展密切相关,在前列腺癌诊断和治疗研究中备受重视。本研究选择人PSCA作为免疫治疗的靶点,以塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus, SFV)复制子载体pSCK为基础,构建用于治疗前列腺癌的可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3,同时为评价疫苗的免疫功能,在大肠杆菌BL21系统中表达和纯化了人PSCA的融合蛋白,构建了可以高效表达人PSCA的小鼠B16细胞系。本研究为pSCK-PSCA3疫苗的免疫功能评价奠定了坚实的实验基础,也为前列腺癌的免疫治疗提供了一种全新策略。方法： (1)利用DNA重组技术将PSCA片段克隆入含有GST标签的原核表达载体pET42a,双酶切鉴定后得到正确的重组质粒pET42a-PSCA,转化大肠杆菌BL21后,IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱对诱导蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定;(2)利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,双酶切及测序鉴定后得到正确的重组质粒pcDNA3.1-PSCA。利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western Blot检测PSCA在细胞系中的表达情况;(3)将sig-PSCA3-Fc-GPI-GM/B7基因片段自pVAX1-PSCA3-FcGB质粒上切下,插入可复制型载体pSCK中,构建可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3,并应用流式细胞术及免疫组化鉴定其在真核细胞中的表达情况。结果： (1)pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western Blot检测显示GST-PSCA融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43KD。 (2) pcDNA3.1-PSCA真核表达质粒构建正确,建立了稳定转染人PSCA的B16细胞系,其表达率接近100%。 (3)成功构建了可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3,流式细胞术及免疫组化检测证明该疫苗可以在真核细胞中有效表达。结论：在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了PSCA融合蛋白,筛选出的B16细胞系可以高效表达PSCA基因,成功构建了可复制型PSCA基因疫苗pSCK-PSCA3,为后续肿瘤疫苗的体内外免疫功能研究奠定了基础。

关键词：前列腺肿瘤前列腺干细胞抗原 DNA疫苗免疫治疗蛋白纯化稳定转染

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L1编码蛋白在肿瘤中功能的初步研究

L1编码蛋白在肿瘤中功能的初步研究

作者：胡明明中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

在基因组内存在着为数众多并能进行移动DNA元件。其中一类是需要经过RNA介导的,称为反转座子(或逆转座子)。由于RNA聚合酶和逆转录酶均无校对功能,就使得逆转座子具有高度变异性。分散在真核生物基因组中的大量逆转座子是基因组不稳定... 详细信息

在基因组内存在着为数众多并能进行移动DNA元件。其中一类是需要经过RNA介导的,称为反转座子(或逆转座子)。由于RNA聚合酶和逆转录酶均无校对功能,就使得逆转座子具有高度变异性。分散在真核生物基因组中的大量逆转座子是基因组不稳定的因素,它们可引起基因序列的删除、扩增、倒位、移位、断裂等异常。LINEs(long interspersed nuclear elements),即长散布核元件,是反转座子家族中最主要成员, LINE-1 (L1)占人类基因组的17%,在人类基因组中获得多达十万份的拷贝数,其中95%以上为5’端缺失,其中10%还存在重排,因此具有序列转座活性的全长L1很少(80-100拷贝)。 L1是进化上保守的一个超基因家族,含有两个开放读码框(open reading frame,ORF)即ORF1和ORF2。ORF2编码一个146KD的蛋白,该蛋白具有核酸内切酶和逆转录酶两种活性,ORF1蛋白是目前发现的唯一一种与已知蛋白没有任何同源性的分子,目前对其认识仅限于这个蛋白能优先结合自身RNA,形成核酸蛋白复合体,与ORF2p一起参与逆转座过程。研究发现,在细胞中ORF1p和ORF2p的表达具有极大的不协调性,ORF1p过量于ORF2p千倍以上,提示ORF1p可能具有其它功能。其转座机制为TPRT(Target primed reverse transcription),即全长L1转录本由细胞核进入细胞质,翻译为转座必需的蛋白质ORF1p和ORF2p,同时这两个蛋白与L1转录本形成核蛋白体复合物,再次进入细胞核,由ORF2p所具有的内切酶功能识别并切割靶位点产生3′OH ,然后由ORF-2p所具有的逆转录酶功能以L1RNA为模板,从切割位点的3′-OH开始引发进行反转录,合成L1-DNA ,新合成的DNA右端与染色体DNA相连,完成转座。研究发现,在几乎所有的肿瘤细胞中L1呈激活状态,且在多种肿瘤细胞中检测到了ORF1p,而在癌旁组织和正常组织中ORF1p表达水平很低或检测不到。故我们认为L1-ORF1蛋白为肿瘤特异表达产物,其联合其它癌基因(蛋白)的检测将为癌症的临床诊断、治疗效果监测和预后提供有重要指标。对于研究一个功能未知的蛋白而言,其抗体的制备工作是至关重要的。基于上述相关背景,我们开展了本课题的研究。本部分实验包括三个部分,即原核表达载体pGEX/L1-ORF1的构建和表达纯化,多克隆抗体制备及鉴定和ORF1p功能的初步探索。在第一部分中,我们选取了原核表达载体pGEX-6P-1,该载体带有IPTG诱导启动子,并且带有GST标签序列,融合蛋白产物可通过GST层析柱可以快速、简便的纯化。通过分子克隆的方法,我们把ORF1基因克隆入此载体,构建了pGEX/L1-ORF1重组表达载体,并通过对表达条件如温度、IPTG浓度、诱导时间等条件的摸索,最终选择IPTG0.2mM,37℃,诱导4h为最优的表达条件,用亲和层析的方法的得到了重组蛋白,并通过SDS-PAGE和Western-blot的方法对其鉴定。在第二部分试验中我们首先将此重组蛋白对兔进行免疫,分离血清,制备了兔抗ORF1p的多克隆抗体。用ELISA的方法,对制备的抗体进行效价检测。然后我们以制备的兔抗L1-ORF1多克隆抗体作为一抗,用Western-blot的方法,分别检测原核表达的目的蛋白和转染ORF1的293细胞,均检测到特异性条带。同时用间接免疫荧光方法直观地观察到了转染的目的蛋白在细胞中的分布,结果显示在细胞核和细胞质中均有表达,这与目前的文献报道是一致的。然后我们以兔抗L1-ORF1多克隆抗体作为一抗,用免疫组化方法观察了四例肝癌患者石蜡切片中的ORF1p的表达情况,并以正常肝组织作为对照,显示在癌组织切片有ORF1p的阳性表达,而在正常肝组织中则未检测到该蛋白。在第三部分实验中,我们对ORF1p进行与自身RNA的体外结合试验,在此过程中,我们用体外转录的方法得到了ORF1和ORF2的转录RNA,并分别与ORF1p共孵育,通过琼脂糖凝胶电泳的方法检测ORF1p与核酸的相互作用,初步显示ORF1p具有结合单链核酸的功能。已完成的部分实验数据证实:在肿瘤细胞中下调L1-ORF1表达,能够减缓多种肿瘤细胞生长,造成转染肿瘤细胞的细胞周期阻滞在S期,过表达L1-ORF1,则得到相反的结果,同时我们还发现多种含有终止密码的L1序列突变体则失去其促增殖作用。有研究显示在多种肿瘤细胞株中使用逆转录酶抑制剂或者RNA干扰技术介导LI序列沉默能减慢细胞增殖并且诱导细胞分化,在动物实验中也得到了一致的结论。此研究为抗肿瘤药物的开发和肿瘤的早期发现、诊断和治疗提供新的分子靶点。

关键词： L1 ORF1p 蛋白纯化多克隆抗体肿瘤

DNA疫苗pSVK-CAVA宿主菌的筛选及其发酵培养基的优化

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DNA疫苗pSVK-CAVA宿主菌的筛选及其发酵培养基的优化

作者：吴昊中南大学

学位级别：硕士

第一章DNA疫苗pSVK-CAVA高稳定性宿主菌的筛选与鉴定目的：从多种不同基因型的大肠杆菌中筛选出适合本研究大分子质粒DNA疫苗的宿主菌,并建立三级种子库。方法：将质粒pSVK-CAVA (14.7kb)转化4种大肠杆菌化学感受态细胞并提取质粒,通过... 详细信息

第一章DNA疫苗pSVK-CAVA高稳定性宿主菌的筛选与鉴定目的：从多种不同基因型的大肠杆菌中筛选出适合本研究大分子质粒DNA疫苗的宿主菌,并建立三级种子库。方法：将质粒pSVK-CAVA (14.7kb)转化4种大肠杆菌化学感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳实验检测质粒的形态结构。对基因工程菌进行生化检测,并通过连续传代法和酶切鉴定进行稳定性检测,同时将质粒DNA瞬时转染至293T细胞中检测质粒表达能力。选取质粒含量最高和稳定性最好的工程菌作为原始种子分装冻存,将原始种子库扩大培养,逐级建立好主种子库和工作种子库,即三级种子库。结果：确定了XL10-Gold作为质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌,基因工程菌传代稳定性和结构稳定性良好,工程菌生化特性未发生改变,质粒能在293T细胞中体外表达,成功建立了达到中试要求的三级种子库。结论：大肠杆菌XL10-Gold适合作为质粒DNA疫苗的宿主菌,解决了大质粒在常用宿主菌中不稳定的难题。第二章响应面法优化质粒DNA疫苗工程菌发酵培养基目的：筛选出基础培养基,并利用统计学方法对肿瘤疫苗工程菌发酵培养基进行优化,提高质粒DNA产量,降低成本。方法：通过摇瓶试验,利用单因素法对几种备选基础培养基进行筛选,之后应用Plackett-Burman试验设计方法和响应面法,对初始培养基7种组分配比进行优化;利用Minitab软件对实验数据进行多元回归分析,并建立3种主要因素与质粒DNA产量之间的函数关系。将最终优化的配方进行3次重复验证实验。结果：筛选出TB培养基为基础培养基,质粒容积产量达到9.9mg/L,比LB培养基提高了接近1倍。培养基3种主要因素的最佳浓度为：酵母提取物16.61g/L,甘油3.05ml/L,硫酸镁0.185g/L,质粒DNA产量能达到12.38mg/L。3次验证实验所测得的质粒DNA产量平均能达到12.28mg/L,与预测结果基本一致。结论：利用响应面法对肿瘤疫苗工程菌发酵培养基优化可以显著提高疫苗质粒DNA产量。

关键词：质粒DNA 宿主菌培养基响应面法

PI3K在细胞程序性坏死中的调控作用与机制研究

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PI3K在细胞程序性坏死中的调控作用与机制研究

作者：胡世平军事科学院

学位级别：硕士

背景:细胞程序性坏死是近年来鉴定的一种新的细胞程序性死亡方式,因细胞死亡时表现出典型的细胞坏死特征,如细胞内出现空泡,细胞器变形或肿大,细胞膜破裂等,故被命名为细胞程序性坏死,也叫坏死样凋亡。细胞程序性坏死参与了多种重要的... 详细信息

背景:细胞程序性坏死是近年来鉴定的一种新的细胞程序性死亡方式,因细胞死亡时表现出典型的细胞坏死特征,如细胞内出现空泡,细胞器变形或肿大,细胞膜破裂等,故被命名为细胞程序性坏死,也叫坏死样凋亡。细胞程序性坏死参与了多种重要的生理与病理过程,如胚胎发育、缺血再灌注损伤、炎症反应及外源微生物入侵(细菌与病毒)导致的机体感染等。因此,鉴定细胞程序性坏死的调控靶点及其调控机制,将进一步揭示细胞程序性坏死的调控机理,并为细胞程序性坏死相关疾病的药物设计和临床治疗提供新的靶标。多种因素都能诱导细胞程序性坏死,但目前研究最为透彻的是TNFα诱导的细胞程序性坏死,其信号转导通路已经被同行研究者广泛认同。在TNFα诱导的细胞程序性坏死过程中,其首先与细胞膜上的受体TNFR1结合,促使TNFR1的胞内结构域构象发生改变,进而招募并结合RIP1和TRADD等多种蛋白,在细胞膜上形成蛋白复合体I。复合体I中的RIP1在E3泛素连接酶c IAP1的作用下发生泛素化修饰,进而结合TAB和TAK1,活化IKK及后续的NF-κB信号通路。RIP1在去泛素化酶CYLD的作用下去除泛素化,从复合物Ⅰ上解离并进入细胞质,与细胞质中的TRADD及FADD等蛋白结合形成复合体II。FADD可以招募并结合caspase8,进而促进caspase 8的剪切及caspase信号通路的活化,诱导细胞凋亡。当利用caspase抑制剂Z-VAD阻断casapse 8活化后,RIP1与细胞内高表达的RIP3通过RHIM结构域结合,形成坏死复合体(necrosome)。坏死复合体中的RIP1或RIP3可以通过RHIM结构域形成同源多聚体,或在活性氧的作用下氧化自身蛋白多肽链中半胱氨酸的二硫键,相互交联形成多聚体。多聚体的形成可以通过自身磷酸化或其它机制促进RIP1与RIP3的磷酸化。RIP3活化后进一步招募并结合下游靶蛋白MLKL,促进MLKL磷酸化及寡聚化,进而转移到细胞膜上并使其破裂,导致细胞程序性坏死的发生。因此,RIP1、RIP3和MLKL是调控细胞程序性坏死的关键靶点,三者组成的RIP1/RIP3/MLKL信号通路在TNFα诱导的细胞程序性坏死过程中发挥着关键性的调控作用。PI3K即磷脂酰肌醇激酶,它既有磷脂酰肌醇激酶活性,也有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。PI3K可分为3类,其结构与功能各异。其中,Ⅰ型PI3K目前研究最为广泛,它是由调节亚基p85和催化亚基p110构成的一个异源二聚体。研究表明PI3K在细胞生长、增殖和生存等过程中均发挥着重要作用,它能通过磷脂酰肌醇激酶活性来活化AKT,从而形成PI3K/AKT信号通路,促进细胞的生存与增殖,抑制细胞凋亡,除此之外,它也能直接活化SGK和PKC等蛋白激酶,促进细胞迁移和存活。然而,最近的研究发现PI3K抑制剂能阻断细胞程序性坏死的发生。因此,PI3K可能在细胞程序性坏死中发挥着关键性的作用,是调控细胞程序性坏死的重要靶点,但其具体机制并不清楚。目的:鉴定PI3K在细胞程序性坏死中的调控作用,并明确其具体调控机制,为程序性坏死相关疾病的治疗及药物研发提供新的靶标和指导。方法:利用TNFα单独或与细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK联合处理L929细胞,构建细胞程序性坏死模型,并用流式细胞仪检测细胞死亡率。利用慢病毒介导的RNA干涉技术构建PI3K催化亚基p110α敲低、RIP1敲低及RIP1与p110α双敲低的的L929细胞株,RT-PCR和Western blot检测p110α和RIP1敲低效果。Western blot检测AKT、RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化水平及RIP1、RIP3、MLKL多聚体的形成,Duolink实验检测RIP1与RIP3的相互作用,p110α与RIP1及RIP3的相互作用及RIP1和RIP3同源多聚体的形成情况。结果:在第一部分研究中我们重点探索了PI3K在细胞程序性坏死中的靶向调控作用。我们发现在经典的细胞程序性坏死模型TNFα诱导的L929细胞程序性坏死过程中,PI3K抑制剂LY294002和A66都具有显著的保护效果,敲低PI3K的催化亚基p110α也具有同样的效果,表明PI3K的确是调控细胞程序性坏死的靶点。同时我们发现AKT抑制剂也能明显阻断TNFα诱导的细胞程序性坏死,鉴于AKT是PI3K的靶蛋白,因此PI3K可能通过活化AKT信号通路从而介导TNFα单独诱导的L929细胞程序性坏死的发生。然而AKT抑制剂对TNFα与Z-VAD联合诱导的L929细胞程序性坏死并没有保护作用,而p110α敲低则完全阻断TNFα与Z-VAD联合诱导的细胞程序性坏死,表明PI3K可能通过其它机制介导TNFα与Z-VAD联合诱导的细胞程序性坏死。因此,在第二部分研究中我们对PI3K调控细胞程序性坏死的具体机制作

关键词：磷脂酰肌醇-3-激酶细胞程序性坏死肿瘤坏死因子受体相互作用蛋白1 受体相互作用蛋白3

蛋白质-DNA复合纳米颗粒抗肿瘤疫苗的初步研究

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蛋白质-DNA复合纳米颗粒抗肿瘤疫苗的初步研究

作者：王浩中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

基因疫苗是近年来刚刚发展起来的一类新型疫苗,由于能诱导细胞和体液双重免疫反应,同时具有产品稳定、运输方便、制造成本低廉的优点,因而具有巨大的开发应用潜力。但目前国内外研究的基因疫苗通常免疫效力较低,激发的免疫应答达不到免... 详细信息

基因疫苗是近年来刚刚发展起来的一类新型疫苗,由于能诱导细胞和体液双重免疫反应,同时具有产品稳定、运输方便、制造成本低廉的优点,因而具有巨大的开发应用潜力。但目前国内外研究的基因疫苗通常免疫效力较低,激发的免疫应答达不到免疫保护要求,成为其进一步产业化开发和应用的巨大障碍。本研究中,我们提出了一种新的基因疫苗增效策略:纳米颗粒疫苗模式。将蛋白质疫苗和基因疫苗,通过电荷作用结合在一起,形成纳米颗粒,同时发挥两种疫苗形式分别在诱导体液免疫和诱导细胞免疫反应方面的优势,并通过形成纳米颗粒,增强抗原递呈细胞对抗原的吞噬、加工和递呈功能,最终提高基因疫苗的免疫效力。首先,本研究以肿瘤特异性抗原凋亡抑制蛋白survivin和人绒毛膜促性腺激素hCG CTP37为靶抗原,通过基因工程的方法,原核表达和纯化出一系列可负载DNA疫苗的特异性复合肿瘤抗原,即:SLC-survivin-IM,单倍体(survivin)1-IM,双倍体(survivin)2-IM以及CTP37-IM。在上述复合抗原蛋白质中,融合了富含阳离子氨基酸的鱼精蛋白短肽,在生理pH下带正电荷,通过静电吸附可以浓缩带负电的DNA。同时蛋白质疫苗中还含有穿膜肽和DNA保护肽,能够增加外源基因向细胞内传递并避免其降解。然后,将重组肿瘤抗原蛋白复合物与含有同一肿瘤抗原基因的肿瘤治疗性DNA疫苗,静电耦合成为复合纳米颗粒,实现基因疫苗的纳米颗粒化。并通过琼脂糖凝胶电泳阻滞实验证明,蛋白质可以通过电荷作用与DNA结合,中和了DNA的电荷,从而阻滞了DNA质粒在电泳中移动;用Dnase消化核酸的保护实验证明,纳米颗粒可保护DNA质粒不被降解;通过原子力显微镜观察证实,蛋白质与DNA质粒形成的纳米颗粒的大小约为50-500nm,呈大小不均一的颗粒化。而这种大小的颗粒,适合抗原递呈细胞的吞噬和抗原加工、递呈。最后,通过体外瞬时转染293T细胞研究表明,蛋白质与DNA质粒形成纳米颗粒后,并不影响基因在细胞中的高效表达,这保证了基因疫苗可以正常发挥作用。总之,该复合纳米颗粒疫苗,是基因疫苗有效投递并发挥免疫保护作用的新模式,可能具备安全、缓释和增强免疫激活等优点。其应用价值和潜力,有待于进一步研究验证。

关键词： DNA疫苗疫苗递送复合纳米颗粒

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前列腺癌相关抗原基因的扩增及真核表达

前列腺癌相关抗原基因的扩增及真核表达

作者：董金凯中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

前列腺癌是危害男性健康常见的恶性肿瘤,在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌,成为危害男性健康第一位的肿瘤。中国的前列腺癌发病率远远低于欧美国家,但近年来也呈现上升趋势。本研究通过特异性扩增前列腺癌相关抗原基因,进行真核表达... 详细信息

前列腺癌是危害男性健康常见的恶性肿瘤,在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌,成为危害男性健康第一位的肿瘤。中国的前列腺癌发病率远远低于欧美国家,但近年来也呈现上升趋势。本研究通过特异性扩增前列腺癌相关抗原基因,进行真核表达,为建立前列腺癌疫苗研究所需要的转基因细胞模型及动物模型奠定了基础。目的:从人前列腺癌细胞系中特异性扩增前列腺癌相关抗原基因,包括前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA),构建真核表达载体,进行真核表达。方法:通过RT-PCR的方法从人前列腺癌细胞系LNCaP中特异性扩增PSCA、PAP、PSMA基因,连接到真核表达载体pIRES-neo中,构建真核表达质粒pIRES-neo-PSCA-His,pIRES-neo-PAP-His,pIRES-neo-PSMA-His。脂质体法瞬时转染COS-7-细胞,应用流式细胞术检测前列腺相关抗原的蛋白表达。随后选择质粒pIRES-neo-PSCA-His,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞,通过G418初步加压筛选,用RT-PCR及免疫荧光和流式细胞术分别检测B16细胞中人PSCA基因的mRNA转录和蛋白表达。结果:特异性扩增得到大小与人PSCA、PAP、PSMA基因相符的基因片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致;成功构建真核表达质粒并转染COS-7细胞,证实质粒可以真核表达。pIRES-neo-PSCA-His质粒成功转染B16细胞并进行初步加压筛选,检测证实质粒可以在B16细胞中表达。结论:特异性扩增出前列腺癌相关抗原基因,成功构建真核表达载体并验证其真核表达。通过G418的初步加压筛选证实所构建的真核表达质粒可以用于下一步转基因细胞系的建立,为前列腺癌疫苗的功能评价研究奠定了基础。

关键词：前列腺癌真核细胞基因表达前列腺干细胞抗原(PSCA) 前列腺酸性磷酸酶(PAP) 前列腺特异性膜抗原(PSMA)

新型可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗的抑瘤活性及免疫学机制研究

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新型可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗的抑瘤活性及免疫学机制研究

作者：殷小涛中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

研究背景：肾细胞癌是成人肾脏肿瘤中最常见的一种类型，进展期肾癌预后相对较差，传统的治疗方式如化疗、放疗都不敏感，细胞因子治疗客观反应率仅为15%，仅对部分患者有效。近年来，DNA疫苗作为一种新的免疫治疗方式在恶性肿瘤治疗... 详细信息

研究背景：肾细胞癌是成人肾脏肿瘤中最常见的一种类型，进展期肾癌预后相对较差，传统的治疗方式如化疗、放疗都不敏感，细胞因子治疗客观反应率仅为15%，仅对部分患者有效。近年来，DNA疫苗作为一种新的免疫治疗方式在恶性肿瘤治疗领域进行了广泛研究。本课题基于自主研发的可复制型DNA疫苗载体系统，成功构建了新型可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗，兼具抗肾癌与抗血管双重功效，希望能够为肾癌的免疫治疗提供一种新的思路。研究目的：本课题的目的是对新型可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗进行药效学评价，分析其可能的免疫机制，并为了进一步评价双质粒疫苗的抑瘤活性，建立同时稳定表达人G250抗原及荧光素酶报告基因的小鼠肾癌单克隆细胞系。研究方法： 1. Renca-hG250/Luc单克隆细胞系的建立：将鉴定正确的pIRES-Luc-hyg质粒利用阳离子脂质体法转染Renca／hG250细胞系，之后利用潮霉素加压筛选和有限稀释法最终获得同时稳定表达人G250基因及荧光素酶报告基因Luc的小鼠肾癌单克隆细胞系Renca-hG250/Luc，并通过Western blot、流式细胞术及细胞体外活体成像检测hG250和Luc的表达情况。 2.双质粒疫苗动物实验研究：双质粒抗肾癌疫苗pSVK-tG250+CAVE及其他对照疫苗通过肌肉注射＋电穿孔的方式免疫Balb/c小鼠，间隔1周共免3次，并在末次免疫后1周皮下接种2×105个Renca-hG250/Luc细胞，建立荷瘤小鼠模型。首先观察肿瘤生长情况及荷瘤小鼠生存时间，评价抑瘤效果;其次研究双质粒疫苗在小鼠体内的免疫学机制：收集免疫后小鼠血清，检测hG250和mVEGFR2特异性IgG抗体水平，以及hG250特异性IgG1/IgG2的比值;处死小鼠并分离脾脏淋巴细胞，CCK-8法检测脾脏淋巴细胞的特异性增值活性，ELISPOT检测hG250及mVEGFR2特异性脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌，ELISA法检测脾脏淋巴细胞Th1类细胞因子（IL-2和INF-γ）的分泌，最后LDH法检测脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性。结果： 1.成功建立了同时稳定表达hG250和荧光素酶报告基因的小鼠肾癌单克隆细胞系Renca-hG250/Luc，其hG250和luc的阳性表达率分别达到81.87%和81.03%，能够有效地与荧光素酶底物发生反应放出荧光。 2.双质粒疫苗pSVK-tG250+CAVE免疫小鼠后，发现与PBS组、pSVK空载体及pSVK-tG250、CAVE单独应用组相比，成瘤时间最多延长10天（P＜0.05），小鼠皮下肿瘤生长明显受到抑制，小鼠的平均生存期延长;双质粒疫苗在肌肉注射加电穿孔免疫方式下能够诱导机体产生较高水平的hG250和mVEGFR2特异性抗体，并且小鼠血清中抗hG250IgG1/IgG2a的比值为0.76，低于其他各组;在hG250和mVEGFR2抗原的刺激下，双质粒疫苗组小鼠脾脏淋巴细胞特异性IFN-γ分泌数分别达到405±52个/5×105和453±61个/5×105脾脏淋巴细胞;此外，双质粒组小鼠脾脏淋巴细胞具有更高的增值活性，hG250抗原刺激后脾脏淋巴细胞培养上清中可检测到Th1类细胞因子IL-2和IFN-γ大量释放;最后，双质粒疫苗组对肾癌靶细胞的CTL杀伤活性得到了明显增强，在效靶比为40:1、20:1和10:1时分别达到51.12%、39.23%和25.88%。结论：新型可复制型抗肾癌双质粒疫苗能够在小鼠体内诱导产生高效的抗肾癌体液免疫应答和细胞免疫应答，具有抗肾癌和抗血管双重功效，有效地抑制肾癌的生长，为肾癌的免疫治疗提供了新的方法。

关键词：肾细胞癌 DNA疫苗电穿孔抑瘤活性免疫学机制

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L1逆转座子编码序列ORF1的功能研究

L1逆转座子编码序列ORF1的功能研究

作者：王越中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

近来研究显示,在基因组中过去认为“垃圾序列”的一些重复序列,可能具有重要的功能。这些重复序列中,大部分是移动元件,包括转座子(transposon)与逆转座子(retrotransposon),其中逆转座子分为含有末端重复序列(LTR,long terminal repea... 详细信息

近来研究显示,在基因组中过去认为“垃圾序列”的一些重复序列,可能具有重要的功能。这些重复序列中,大部分是移动元件,包括转座子(transposon)与逆转座子(retrotransposon),其中逆转座子分为含有末端重复序列(LTR,long terminal repeats)与非含有末端重复序列两类,后者为SINEs(short interspersed nuclear elements,短散布重复序列)和LINEs(long interspersed nuclear elements,长散布重复序列)。在LINEs中LINE-1是其主要组成成员,在基因组中,绝大部分LINE-1是以5’截短的形式存在,全长基因包括两个开放阅读框ORF1和ORF2,表达两种蛋白ORF-1p和ORF-2p,相对于ORF-2p,ORF-1p的表达大大过量。其中ORF-1p具有与自身核酸结合活性,形成核酸蛋白复合物(RNP),而ORF-2p具有内核酸酶及外切酶活性,与ORF1p一起执行逆转座功能,其机制为TPRT(Target-primed reverse transcription)。在正常分化的细胞中,LINE-1的启动子为高度甲基化状态,造成其沉默,但生殖细胞发育、胚胎发育的早期以及肿瘤细胞中则为激活状态。研究表明在几乎所有的肿瘤细胞中L1均为激活状态,提示其激活可能涉及肿瘤发生的共同机制。所以通过L1的研究对了解肿瘤发生、发展和调控的分子机理以及肿瘤药物靶标具有重要意义,同时也为开发新型的肿瘤治疗药物提供新的靶点。研究发现,ORF-1p与目前所有已知蛋白均缺乏同源性,同时其表达量又远过量于与其共同参与转座的ORF-2p,提示其在肿瘤细胞中可能具有重要的作用。本研究对其进行了有关探索。主要表现一下几个方面:(1)ORF-1p过表达对细胞生物学特征的影响:在此过程中,我们分别构建含有人L1-ORF1p完整、突变体序列重组表达载体以及小鼠ML1-ORF1p重组表达载体,转染细胞后进行RT-PCR、Western Blot以及流式细胞术方法检测,为进一步研究L1-ORF1蛋白及基因的功能提供了基础。结果显示,人与小鼠ORF1p完整蛋白均能显著促进细胞增殖,在人L1-ORF1p不同突变体中,位于第109氨基酸处终止突变的全长序列也能促进细胞增殖,随后对含有109氨基酸的基因进行表达发现,其表达产物不能促进细胞增殖,另外其它全长多处点突变的ORF1p也不能促进细胞增殖,多处突变会造成蛋白高级结构的改变,从而影响其功能的执行,同时非全长蛋白在其全长RNA的帮助下具有全长蛋白功能,说明ORF1在基因水平影响细胞增殖。随后对转染细胞的其它细胞生物学特征进行了鉴定,发现小鼠ORF1p的表达能显著减少NIH3T3细胞周期S期,促进小鼠NIH3T3细胞的细胞周期运转。人ORF1p的天然以及ORF1p109突变的全长构建体表达产物能够使HEK293细胞的S期减少,加快细胞周期运转,而全长突变蛋白ORF1pm、ORF1p48以及ORF1p109e则对细胞周期的S期则没有显著的影响,此结果与细胞增殖实验结果一致。在正常细胞中过表达L1-ORF1p可促进细胞增殖,加快细胞周期,在109氨基酸处带有终止密码的全长基因突变体具有相同的作用,而终止密码位于其它部位的突变体则没有相似的作用,以上提示L1-ORF1的功能可能在RNA水平上起作用,而且与RNA中特异的序列有关。(2)5’端不同长度截短的L1-ORF1序列对相邻基因的影响:在此过程中,我们构建了L1-ORF1基因插入到报告基因上下游的报告基因表达载体,由于在天然存在的状态下L1常存在5’端缺失,所以本研究选取三种不同长度的L1-ORF1片段,分别是全长片段、2/3全长片段(5’端截短1/3)、1/3全长片段(5’端截短2/3)。通过设计引物插入酶切位点将人和小鼠的三种不同片段分别插入到pCBG99-control报告基因表达载体中萤光素酶报告基因的上游和下游。为进一步检测L1-ORF1基因对相邻基因表达影响提供了条件。结果显示,L1-ORF1基因片段在报告基因上游和下游都能抑制报告基因的表达,而且基因片段的不同片段(5’端截短)对报告基因的表达也有不同的影响。在插入报告基因上游,L1-ORF1基因片段对报告基因影响最为显著的是只含3’端1/3的小片段,其可能原因是此区域位于基因保守区含有特定结构域;在插入报告基因下游,L1-ORF1基因片段对报告基因的影响随片段长度增加而加强。(3)L1-ORF1序列对相邻基因表达影响的机制:在此过程中,我们对细胞进行甲基化抑制处理,结果显示在甲基转移酶受到抑制的情况下,L1-ORF1基因对萤光素酶报告基因的抑制作用有明

关键词： LINE-1 ORF1 细胞增殖基因表达调控